[发明专利]一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法及储存方法

权利要求书

1.一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

一、合成油酸-Fe₃O₄

(1.1)、在通氮气的条件下，将FeCl₂·4H₂O、FeCl₃·6H₂O溶解于800ml蒸馏水中，加热回流，加热至90℃时，在机械搅拌的同时，把346ml NaOH溶液加入以上溶液中；

(1.2)、加入20ml油酸，90℃条件下，搅拌1小时后停止反应；

(1.3)、待溶液冷却至室温后,外加磁场吸附出沉淀，然后用蒸馏水清洗1-7次，产物即为油酸-Fe₃O₄；

二、Fe₃O₄/PVAc磁性微球制备

(2.1)、向安装有搅拌器、冷凝管、温度计及导气管的四口烧瓶中加入100ml水，水浴加热回流，通入氮气脱气20min；

(2.2)、加入表面活性剂和助表面活性剂，搅拌使充分混匀；

(2.3)、加入10ml含有0.4g油酸-Fe₃O₄纳米颗粒的醋酸乙烯酯混合溶液，搅拌使充分混匀；

(2.4)、温度均匀上升，在45-60℃的范围内停留30-120min，当反应体系温度升高到80℃，加入过氧化苯甲酰0.5g，恒温反应8h，随着反应的进行，液体颜色有黑色变为红棕色；

(2.5)、反应结束后，利用外加磁场将产物从溶液中分离出来，即将Fe₃O₄/PVAc从溶液中分离出来，用无水乙醇溶液清洗3次，并且分散在200ml无水乙醇溶液中；

三、(Fe₃O₄/PVA)/SiO₂磁性微球的制备

(3.1)、将以上所得颗粒分散在200ml乙醇和水混合液中，将以上混合溶液超声10min，使其均匀分散；

(3.2)、根据选择生成的SiO₂壳的厚度，向溶液中加入正硅酸乙酯，然后搅拌30min；

(3.3)、加入7ml NaOH溶液，室温下搅拌3h，最后利用外加磁场将终产物分离，再用乙醇清洗三次后，再分散在无水乙醇中；

四、磁性颗粒的氨基化修饰

将0.4ml 3-氨丙基三乙氧基硅烷滴加到磁性微球(Fe₃O₄/PVA)/SiO₂的乙醇悬浮液中，室温下搅拌7h氨基化，利用外加磁场从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗五次备用；

五、磁性颗粒的醛基化修饰

将氨基化的磁性纳米颗粒加入到50ml3％戊二醛的PBS溶液中，37℃下搅拌3h，通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团，反应结束后利用外加磁场从反应介质中分离出颗粒，用PBS溶液反复冲洗产物，将颗粒分散在PBS溶液中，终浓度为8μg/μl；

六、抗体的肼基化修饰

将5μL含对-丙腙基吡啶甲酸N-羟基琥珀酰亚胺脂的二甲基甲酰胺溶液加入到100μLCD45抗体溶液中，室温反应2h后，用超滤柱纯化得到肼基修饰的CD45抗体；

七、免疫磁珠的制备

将1mg醛基修饰的磁性微球与0.01mg肼基修饰的CD45抗体混合，在4-25℃下PH值6.0的PBS缓冲液中混合2h-24h,在磁分离作用下得到CD45抗体偶联磁性微球的CD45抗体免疫磁珠。

2.根据权利要求1所述的一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1.1)中，所述的NaOH溶液的浓度为1mol/L。

3.根据权利要求1或2所述的一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1.1)中，所述的FeCl₂·4H₂O、FeCl₃·6H₂O、NaOH的摩尔比为1:2:8。

4.根据权利要求1所述的一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2.2)中，所述的表面活性剂为十六烷基三甲氧基溴化铵，所述的助表面活性剂采用正丁醇，所述的十六烷基三甲氧基溴化铵为0.3g，所述的正丁醇为3ml。