[发明专利]一种酶固定化方法及其应用

说明书

本发明提供一种酶固定化方法及其应用。该固定化方法利用磁感应蛋白与靶蛋白的直接融合，然后通过融合蛋白对纳米铁珠的吸附，从而实现酶的固定化。该方法可提高固定化酶的热稳定性和更强的pH耐受性，所制备的固定化酶在重复利用15次后，其相对活性仍然高达80％，在重复利用20次后，其相对活性仍然高达75％。本发明提供了一种操作简单的、效率提高的以及成本降低的酶固定化方法及其应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种酶固定化方法及其应用。

背景技术

动物是否能够检测到地球的磁场，以及它们如何通过感应磁场来实现定向或迁移，这是最有争议的话题之一。许多研究人员致力于识别磁感应，并寻找磁受体。最近，有研究人员发现并报道了一个磁蛋白生物指南针，它是一个多聚磁感应棒状蛋白复合体，这种磁敏复合体是由已鉴定的假定的磁感应蛋白MagR和已知的磁受体相关的光感受器隐花色素Cry组成，有Cry系统和铁基系统两者的特性，在包括地球在内的磁场中能自发排列。并且验证了蛋白质复合体具有固有磁矩。此外，这样的蛋白质复合体已被证明在物种之间广泛分布，并且相信会激发跨领域的技术创新。

磁感应蛋白MagR属于铁硫簇结合蛋白(简称铁硫蛋白)，每一个蛋白质单体都结合了一个二铁二硫形式的铁硫簇。磁感应蛋白MagR具有明显的内禀磁矩和清晰的物理模型，其必然掀起生物感磁研究的新一波热潮，推动整个生物磁感受能力研究的发展。

分离和纯化蛋白质是生物技术中的重要加工过程。等电点、十二烷基硫酸钠和凝胶过滤层析等传统方法已经应用于各种蛋白质的纯化。在低浓度蛋白质的情况下，分离和纯化意味着更具有挑战性。目前，已经开发的几种融合标签和亲和色谱法提供了一种有效方式来纯化目的融合蛋白。然而，高成本的亲和柱和耗时的操作限制了其大规模的可用性。通常而言，固定化酶能够回收和再利用昂贵的酶，并且提高成本效益。尽管进行了许多尝试来开发和优化固定化方法，但是终于发现，比表面积大和量子尺寸效应的氧化铁纳米颗粒提供了一种快速，方便和经济的固定化酶的方法。然而，先前的酶纯化是必要的，然后是磁性固定，这对工业应用造成沉重的负担。因此，实现酶的一步纯化和固定化是很必要的。虽然Ni²⁺官能化修饰的聚多巴胺包被的Fe₃O₄纳米粒子可以用于分离纯化his标签蛋白。氨基官能化的MCFs的生产是用于粘附醛标签酶。连接DNA配体的磁珠的制备是应用于β-葡萄糖醛酸酶的分离纯化。然而，氧化铁纳米颗粒的表面修饰应当在纯化和固定之前完成和评价，并且修饰后的纳米颗粒的不稳定性也限制了它的重复使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶固定化方法及其应用，从而解决现有技术中外源蛋白表达量低，分离纯化困难的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种利用磁感应蛋白作为纯化标签实现外源蛋白一步纯化与固定化的方法，所述方法包括以下步骤：1)以pET-28a(+)为载体质粒，向其中插入磁感应蛋白基因，构建一通用载体；2)将外源蛋白基因可操作地插入所述步骤1)中的通用载体中，构建含有外源蛋白基因的重组表达质粒，再将该重组表达质粒导入宿主细胞，获得重组菌株；以及3)培养所述重组菌株，诱导所述外源蛋白基因表达，收集表达产物，向所述表达产物中投入纳米铁珠，实现所述外源蛋白的一步分离纯化与固定化。

优选地，所述磁感应蛋白基因是一种来自哺乳动物家鸽的磁感应蛋白基因或一种来自果蝇的磁感应蛋白基因，其中来自哺乳动物家鸽的磁感应蛋白基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，来自果蝇的磁感应蛋白基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

优选地，所述步骤1)中通用载体的构建还包括在所述磁感应蛋白基因序列的下游插入凝血酶切割位点。通过在通用载体中引入该凝血酶切割位点，在外源蛋白以及磁感应蛋白共表达之后，仅仅通过向表达产物中加入凝血酶，即可实现对磁感应蛋白标签的切割，获得更加接近天然序列的外源蛋白。