[发明专利]Taqman-MGB探针检测绵羊BMPR-IB基因A746G突变的试剂盒和方法

权利要求书

1.检测绵羊BMPR-IB基因A746G突变的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含阳性对照、DNA提取液Ⅰ、DNA提取液Ⅱ、2×LightCycler 480 probes master、一对引物BMF和BMR，以及其对应的探针BPA和BPG、ddH₂O；

其中DNA提取液Ⅰ、DNA提取液Ⅱ，其组成成分如下：

DNA提取液Ⅰ：0.01mol/L Tris，0.01mol/L NaCL，0.005～0.01mol/L MgCl₂﹒6H₂O；

DNA提取液Ⅱ：10mmol/L Tris，0.1mmol/L EDTA-Na₂﹒2H₂O，0.1～1％TritonX-100；

其上游引物BMF的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

其下游引物BMR的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示；

其野生探针BPA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；

其突变探针BPG的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示；

所述野生探针BPA的5’一端标记有荧光基团1，3'一端标记有MGB淬灭基团；所述突变探针BPG的5’一端标记有荧光基团2，3'一端标记有MGB淬灭基团；

其中所述的荧光基团1或荧光基团2为FAM、TET、VIC、HEX或ROX中的一种，且荧光基团1与荧光基团2不相同。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒中所包含的阳性对照样品为三个，分别对应绵羊BMPR-IB基因的++、B+和BB三种基因型。

3.一种利用权利要求2所述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

(1)从绵羊血液中提取基因组DNA:

(a)取无菌的1.5ml离心管，向其中加入混匀的EDTA抗凝血200μl和DNA提取液Ⅰ溶液600μl，充分混匀,室温静置10min；将离心管置于离心机中，6000rpm离心1min；

(b)取出离心管，倾去上清液，保留沉淀；向离心管中加入DNA提取液Ⅱ溶液60μl，充分振荡混匀；沸水浴中10min；

(c)取出离心管，置离心机中，12,000rpm离心10min，离心后上清液可用于后续实验；

(2)将步骤(1)得到的DNA加入到PCR反应液中，取所述引物和探针，进行实时荧光定量PCR扩增，获得绵羊的BMPR-IB基因包含A746G突变位点的基因片段；

(3)根据检测到的荧光信号对绵羊BMPR-IB基因A746G位点的三种基因型进行判定，即++、B+和BB基因型。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中实时荧光定量PCR反应所使用的扩增体系为20μL，扩增体系中包含以下溶液或试剂：2×LightCycler 480 probesmaster 10μL，10μmol/L上游引物BMF 0.8μL，10μmol/L下游引物BMR 0.8μL，10μmol/L野生探针BPA0.4μL，10μmol/L突变探针BPG0.4μL，基因组DNA3μL，去离子水补齐至20μL。

5.如权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中实时荧光定量PCR反应所使用的扩增程序为95℃预变性10min；95℃变性10sec，55℃退火30sec，72℃延伸1sec，45个循环。