[发明专利]同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法

权利要求书

1.一种同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法，其特征在于，以目标化合物相应的同位素为内标，水样经过滤、液液萃取浓缩后、经中性氧化铝小柱净化、浓缩后，用乙腈-5mmol/L乙酸铵溶液(V:V,1:1)1mL定容，涡旋振荡过滤后用液质联用仪检测。

2.根据权利要求1所述同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)将待测养殖水样经孔径为0.45μm的水系纤维滤膜过滤，除去固体杂质和色素，备用；

(2)移取经步骤(1)处理的待测养殖水样100.0mL，置于250mL分液漏斗中；向分液漏斗中加入质量浓度为100ng/mL的氘代孔雀石绿和氘代结晶紫混合标准工作溶液20.0μL、1.5mL盐酸羟胺溶液、2.5mL对-甲苯磺酸溶液，振摇混匀，加入10.0mL乙腈、35.0mL二氯甲烷，剧烈振摇3min，静置分层10min，将下层溶液转移至125mL鸡心瓶中；继续向分液漏斗中加入10.0mL乙腈、35.0mL二氯甲烷，剧烈振摇3min，静置分层10min，合并下层溶液于上述125mL鸡心瓶中，于42±2℃水浴中减压浓缩至近干；用5mL乙腈溶解残留物，振荡混匀；将用5mL乙腈活化过的中性氧化铝小柱安装在固相萃取装置上，将鸡心瓶中的溶液转移到柱上，再用乙腈洗涤鸡心瓶两次，每次2.5mL，将洗涤液依次过柱，收集全部流出液，于42℃±2℃的水浴中减压浓缩至近干，向鸡心瓶中加入1.0mL乙腈--5mmol/L乙酸铵溶液(V:V,1:1)，涡旋振荡1min，样液经0.22μm针孔式有机相滤膜过滤后，得到试样液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；

(3)移取适量的孔雀石绿与结晶紫混合标准工作溶液，加入氘代孔雀石绿和氘代结晶紫混合标准工作溶液，用乙腈-5mmol/L乙酸铵溶液(V:V,1:1)配制成一系列浓度的标准上机溶液，进高效液相色谱-串联质谱仪分析，绘制标准曲线；

所述高效液相色谱-串联质谱仪分析的检测条件为：

色谱条件：

a)色谱柱：Waters BEH C18反相色谱柱，2.1mm×100mm，粒度1.7μm；

b)柱温：40℃；

c)流速：0.3mL/min；

d)进样量：1μL；

e)流动相：A:0.1％的甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱；洗脱程序为：0min，A为50％，B为50％；2～3min，A为20％，B为80％；4min，A为50％，B为50％；4～5min，A为50％，B为50％。

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式；

去溶剂气温度：500℃；

雾化气、干燥气为高纯氮气，气体流量：900L/Hr；碰撞气为氩气，输出压力为0.06MPa；

离子模式：多反应监测扫描模式；

选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和锥孔电压质谱参数分别为：孔雀石绿母离子329，定量子离子313，碰撞能量35，锥孔电压54，定性子离子208，碰撞能量37，锥孔电压54；氘代孔雀石绿母离子334，定量子离子318，碰撞能量40，锥孔电压54；结晶紫母离子372，定量子离子356，碰撞能量38，锥孔电压60，定性子离子251，碰撞能量42，锥孔电压60；氘代结晶紫母离子378，定量子离子362，碰撞能量39，锥孔电压60；

(4)测定：

①定性测定：在与标准工作溶液相同的测定条件下对试样液进行测定，试样液中目标化合物的保留时间与标准工作液中目标化合物保留时间的相对标准偏差在±5％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相近的标准溶液中定性离子相对丰度一致；

②定量测定：

取相应的标准工作溶液，作多点校准，按内标法对试样溶液定量；标准溶液及试样溶液中目标化合物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。孔雀石绿和结晶紫以各自的同位素为内标进行定量；

③空白实验

除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行；

④结果计算和表述

按公式(a)计算试样中目标化合物的残留量：

Xi=(Ci-C0)×V1V2---(a)]]>

式中：X_i―试样中目标化合物的残留量，ng/L；C_i—试样溶液中目标化合物的浓度，ng/L；C₀—空白样品中目标化合物的浓度，ng/L；V₁—最终样液定容体积，mL；V₂—样品体积，mL；

⑤方法灵敏度、准确度和精密度：

灵敏度：孔雀石绿和结晶紫的检出限均为1ng/L，定量限均为2ng/L；

准确度：孔雀石绿和结晶紫在2ng/L～20ng/L添加浓度范围内时，回收率为70％～120％。

精密度：本方法的批内相对标准偏差≤10％，批间相对标准偏差≤15％。

3.根据权利要求2所述同时测定养殖用水中孔雀石绿和结晶紫残留量的方法，其特征在于，步骤(3)标准曲线绘制时，孔雀石绿和结晶紫混合标准溶液的浓度梯度为：0.2ng/mL、0.4ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL和10.0ng/mL，每毫升该溶液含有氘代孔雀石绿和氘代结晶紫各为2.0ng。