[发明专利]人工改造的PCV2 Rep蛋白、重组PCV2病毒及其应用

权利要求书

1.一种人工改造的PCV2 Rep蛋白，其特征在于缺失了野生型PCV2 Rep蛋白第6-8位的三个氨基酸SGR，和/或在野生型PCV2 Rep蛋白第293位E和294位E之间插入了氨基酸V；所述野生型PCV2 Rep蛋白氨基酸的位置编号参考SEQ ID NO:1确定。

2.一种降低PCV2体外复制能力的方法，其特征在于敲除PCV2 Rep蛋白第6-8位的三个氨基酸SGR；所述野生型PCV2 Rep蛋白氨基酸的位置编号参考SEQ ID NO:1确定。

3.一种增强PCV2体外复制能力的方法，其特征在于在野生型PCV2 Rep蛋白第293位E和294位E之间插入了氨基酸V；所述野生型PCV2 Rep蛋白氨基酸的位置编号参考SEQ ID NO:1确定。

4.一种重组PCV2，其特征在于所述PCV2的Rep蛋白经过突变，缺失了第6-8位的三个氨基酸SGR，和/或在第293位E和294位E之间插入了氨基酸V；所述PCV2 Rep蛋白氨基酸的位置编号参考SEQ ID NO:1确定。

5.权利要求1所述人工改造的PCV2 Rep蛋白的编码核酸。

6.一种单拷贝突变体PCV2-vV、PCV2-dSGR感染性克隆的构建方法， 包括以下步骤：

（1）设计引物序列如下：

P1：5’-TGTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGA-3’,

P2： 5’-GCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’,

vV-R：5’-CTGGCCCCCTTCTACCTCCGTGGAT-3’,

vV-F： 5’-ATCCACGGAGGTAGAAGGGGGCCAG-3’,

dSGR-F： 5’-CATGCCCAGCAAGAAGAGCGG ACCCCAACCACATAAAAGG-3’,

dSGR-R：5’-TTGGGGTCCGCT CTTCTTGCTGGGCATGTTGCTGCTGA-3’,

（2）以pEASY-Blunt-PCV2为模板，分别以P1和vV-R及P1和dSGR-R引物扩增上游片段，分别以P2和vV-F及P2和dSGR-F引物扩增下游片段，分别纯化回收，

（3）以上述胶回收得到的dSGR上、下游目的DNA产物为模板，以P1和P2引物扩增获得dSGR突变体全长PCR产物；以上述胶回收得到的vV上、下游目的DNA产物为模板，以P1和P2引物扩增获得vV突变体全长PCR产物；dSGR突变体全长PCR产物和vV突变体全长PCR产物纯化回收后分别与克隆载体pEASY-Blunt连接，转化至感受态细胞中，分别提取质粒得pEASY-Blunt-vV和pEASY-Blunt-dSGR。