[发明专利]人工改造的PCV2 Rep蛋白、重组PCV2病毒及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种人工改造的PCV2 Rep蛋白，还涉及重组PCV2病毒及其应用。本发明提供一种人工改造的PCV2 Rep蛋白，缺失了野生型PCV2 Rep蛋白第6‑8位的三个氨基酸SGR，和/或在野生型PCV2 Rep蛋白第293位E和294位E之间插入了氨基酸V；野生型PCV2 Rep蛋白氨基酸的位置编号参考SEQ ID NO:1确定。人工改造的PCV2 Rep蛋白或者重组PCV2病毒在制备预防或治疗PCV2疫苗中的应用。明确Rep蛋白相应氨基酸位点突变对病毒复制的影响，为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供参考，同时这为PCV2的致病机理研究及疫苗免疫效果评价等奠定了理论基础。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种人工改造的PCV2 Rep蛋白，还涉及重组PCV2病毒，进一步涉及人工改造的PCV2 Rep蛋白、重组PCV2病毒的应用。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）为圆环病毒科，圆环病毒属成员，分为PCV1和PCV2两个血清型。PCV1不引起猪发病；PCV2被证明是导致断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。PCV2基因组主要包括2个大的阅读框架（ORFs），ORF1基因编码病毒复制酶（Rep/Rep’），ORF2基因编码病毒核衣壳蛋白（Cap）。Cap蛋白能够诱导机体产生免疫应答，产生抗PCV2的中和性抗体，是分子诊断方法的建立及亚单位疫苗制备的理想靶抗原。自然感染PCV2可同时产生Cap与Rep/Rep’抗体。因此，对Rep/Rep’蛋白免疫特性了解及其自然感染与疫苗免疫间鉴别诊断尤为重要。

猪圆环病毒2型主要有与病毒复制相关的Rep蛋白，与免疫原性相关的Cap蛋白及ORF3编码的与细胞凋亡相关的非结构蛋白三种蛋白。其中Rep蛋白是PCV2复制的催化成分，对于Rep蛋白的深入研究，将有助于了解PCV2病毒的复制和致病机理。糖基化作为一种主要的翻译后修饰对蛋白质功能有着重要影响，病毒蛋白的糖基化在病毒的生命周期中起着重要的作用。50％以上的蛋白质存在糖基化现象，其中Rep蛋白含有三个N-糖基化位点。

青岛农业大学, 徐胜男 在2015发表文章“PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制及致病性的影响”，分析PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响，获得三个单点突变和一个未突变的双拷贝PCV2全长感染性克隆，分别命名为2M23、2M256、2M286、2PCV2，接种无污染的PK-15细胞，体外拯救突变体病毒。通过间接免疫荧光检测病毒的拯救效果，TCID50测定病毒的感染力，荧光定量PCR检测细胞病毒的载量。结果显示，PCV2 Rep蛋白的23～25aa、256～258aa N-糖基化位点突变后降低病毒的复制能力，而286～288aa突变后增强病毒的复制能力。王鹏等在2013年的中国畜牧兽医学会学术年会发表“PCV2Rep蛋白N-糖基化位点突变体感染性克隆的构建”, 对PCV2Rep蛋白上N-糖基化位点23aa-25aa(NPS)、256aa-258aa(NQT)和286aa-288aa(NAT)分别进行单点、双点和三点突变(将N突变为D),成功构建7个突变体感染性克隆。

上述对Rep蛋白的N-糖基化位点的研究，并没有充分挖掘完其价值，因此需要在此领域有更多进一步的研究。

发明内容

为了解决以上现有技术中对Rep蛋白的研究还不够充分的问题，本发明提供了一种人工改造的PCV2 Rep蛋白,具体而言：

第一方面,本发明提供一种人工改造的PCV2 Rep蛋白，其特征在于缺失了野生型PCV2 Rep蛋白第6-8位的三个氨基酸SGR，和/或在野生型PCV2 Rep蛋白第293位E和294位E之间插入了氨基酸V；所述野生型PCV2 Rep蛋白氨基酸的位置编号参考SEQ ID NO:1确定。

第二方面,本发明提供一种降低PCV2体外复制能力的方法，其特征在于敲除PCV2Rep蛋白第6-8位的三个氨基酸SGR。