[发明专利]干细胞外泌体的分离方法

说明书

本发明涉及一种干细胞外泌体的分离方法，包括如下步骤：采用含血清培养基培养干细胞至细胞密度大于70％，收集干细胞，然后采用不含血清培养基继续培养；收集得到的产物中的培养基，然后过滤，收集滤液；将滤液加入第一浓缩管，离心，得到浓缩液；将浓缩液分装于第二浓缩管，离心；在第二浓缩管中加入缓冲液，再次离心；将再次离心后的第二浓缩管的内管倒置于收集管中，离心，收集管中的液体为含高浓度干细胞外泌体的溶液。本发明提供的干细胞外泌体的分离方法，通过联合运用大小不同的浓缩管，可以实现快速、高效、廉价地提取培养基中的外泌体；并且离心时间较短，可有效减少外泌体的机械性损伤，更好地保留外泌体的活性。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种干细胞外泌体的分离方法。

背景技术

外泌体(exosome)是由细胞内的多泡体(multivesicular body,MVB)与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30～150nm的膜性囊泡。很多细胞均能分泌外泌体，如T细胞、B细胞、树突细胞、肥大细胞和肿瘤细胞等。外泌体中包含有多种蛋白质和RNA,在细胞之间起到传通信息和相互调控的作用，而这种传速信息的方式和相互调控的机制并不完全清楚，尤其是在肿瘤细胞之间：外泌体是否将癌细胞的特征信息传速到了癌旁组织，并通过所包含的蛋白促进其癌变；外泌体是否对月中瘤细胞的迁移、增殖以及浸调有影响等。这些急待解决的问题都遇到了一个共同的瓶颈，那就是外泌体的提取与分离。现有技术中的外泌体的分离方法包括：(1)超高速离心或者是密度梯度离心，这种方法有一个限制因素，那就是需要配各超高速高心机，而这种设备的价格是非常昂贵的，因此限制了一些中小型实验室对外泌体的研究；(2)用超滤的方法，单纯的超滤方法收集的外泌体浓度不能达到很高，对于需要较高浓度外泌体的检测与治疗等应用也是一种限制。因此，还需要寻求新型的低成本高效率的分离纯化干细胞外泌体的方法，来克服现有技术中存在的缺陷。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种干细胞外泌体的分离方法，以通过联合运用大小不同的浓缩管，实现快速、高效、廉价地提取培养基中的外泌体；并且离心时间较短，可有效减少外泌体的机械性损伤，更好地保留外泌体的活性。

为实现上述目的，本发明提供了一种干细胞外泌体的分离方法，包括如下步骤：S1：采用含血清培养基培养干细胞至细胞密度大于70％，收集干细胞，然后采用不含血清培养基对干细胞继续培养；S2：除去S1得到的培养体系中的干细胞，然后将剩余组分过滤，收集滤液；S3：将滤液加入第一浓缩管，离心，得到浓缩液；S4：将浓缩液分装于第二浓缩管，离心；然后在第二浓缩管中加入缓冲液，再次离心；S5：将再次离心后的第二浓缩管的内管倒置于收集管中，离心，收集管中的液体为含高浓度干细胞外泌体的溶液。需要说明的是，S4中，缓冲液的体积和第二浓缩管的容积的比值优选为(0.4～0.6):1；本发明采用的干细胞可以是hASCs干细胞。

在本发明的进一步实施方式中，S1中，含血清培养基为含有质量分数为10％的FBS(胎牛血清)的DMEM培养基；不含血清培养基为DMEM培养基；继续培养的时间为23～25h。

在本发明的进一步实施方式中，S2中，过滤为采用0.22μm过滤膜过滤。

在本发明的进一步实施方式中，S3中，第一浓缩管为15mL10KD浓缩管；S4中，第二浓缩管为0.5mL10KD浓缩管。

在本发明的进一步实施方式中，S3中，离心条件为：4℃，3500～4500g离心35～45min；S4中，离心和再次离心的条件均为：常温，15000g离心8～12min；S5中，离心条件为：常温，900～1100g离心1.5～2.5min。需要说明的是，常温是指15～30℃。

在本发明的进一步实施方式中，S4中，缓冲液包括：0.01MPBS缓冲液；其中，PBS缓冲液的pH值为7.2～7.4。