[发明专利]一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法

权利要求书

1.一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其特征在于：该模型的构建方法的主要步骤为：

微流控芯片的制备；

拟胚体EBs的形成；

类脑在微流控芯片中的分化和发育；

所述微流控芯片包括：细胞外基质混悬液入口（1）、三维通道（2）、二维灌流通道（3）、二维培养基通道（4）和培养液入口（5），所述二维灌流通道（3）、二维培养基通道（4）和三维通道（2）交界处有小柱形状的连通处，可用于营养物质传输；

步骤（1）微流控芯片的制备方法为：所述微流控芯片由上下两层不可逆封接而成，上下层材料均为透明透气的生物相容性材料聚二甲基硅氧烷的聚合物，然后上下两层聚合物材料经过氧气等离子体处理60-90秒进行不可逆封接；封接之后，经过高温高压灭菌处理备用；

步骤（2）拟胚体EBs的形成，具体步骤为：

（1）选择带有坑状结构的PDMS芯片：将坑状结构的PDMS芯片置于24孔板内，小坑结构直径为600-800 µm，深度为100-300 µm，用于EBs的形成；

（2）使用带有坑状结构的PDMS芯片制备EBs：第1天，制备EBs，将2×10⁵~6×10⁵个干细胞消化成单细胞，并转移至PDMS芯片中，离心500-800 rpm，3-5 min，所用培养基为KSR培养基，并加入5 μM Y27632和4 ng/ml bFGF；

（3）第2天，将形成的EBs转移至低粘附的培养板中，悬浮培养，所用培养基为KSR培养基；

（4）第5天，诱导EBs向神经上皮方向分化，将KSR培养基替换为神经诱导培养基NIM；

步骤（3）类脑在微流控芯片中的分化和发育，具体步骤为：

（1）拟胚体EBs在诱导培养基NIM中培养到第11天时，将EBs转移到微流控芯片上，使用浓度为2-10 mg/ml的Matrigel重悬EBs，并用100 μl的去尖枪头将EBs注入微流控芯片的三维通道内，整个过程避免产生气泡，确保冰上操作维持低温，保证Matrigel不凝固；

（2）将含有EBs的微流控芯片置于37℃培养箱30-40 min，使Matrigel凝固；

（3）将含有EBs的微流控芯片二维培养基通道内补加培养基，静止培养6-8 h，所用培养基为神经分化培养基NDM；

（4）灌流操作：含有细胞团的微流控芯片静止培养6-8 h后，在二维灌流通道中插入一定长度的PTFE管，连接注射器和注射泵，设置流速20-40 μl/h，将芯片放入培养箱中进行灌流培养，继续培养15-30天后，并实时追踪，鉴定发现微流控芯片上的EBs可以进行持续的生长和分化，经鉴定可以形成含有不连续的特定脑区及类似大脑皮层结构的类脑，可模拟早期的脑发育过程;

所述KSR培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积20％ 的KnockOutReplacement，占总体积1％NEAA，占总体积1％GlutaMax，占总体积1％penicillin-streptomycin，以及0.1 mM beta-mercaptoethanol，4ng/ml bFGF；

所述NIM培养基的基础成分为DMEM/F12，另外需添加占总体积1％N2；占总体积1％GlutaMAX，占总体积1％NEAA，1 µg/ml heparin，占总体积1％penicillin-streptomycin；

所述NDM培养基，所用培养基为神经分化培养起，其基础成分为体积比为1:1的DMEM/F12和Neuralbasal medium，另外需添加占总体积1％ B27，占总体积0.5％N2，占总体积0.5％ NEAA，占总体积1％GlutaMAX，占总体积1％penicillin-streptomycin，0.05 mMbeta-mercaptoethanol。

2.按照权利要求1所述的一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其特征在于：所述微流控芯片结构的宽度不等，二维灌流通道（3）和二维培养基通道（4）的宽度均为0.5 mm-1 mm，三维通道（2）的宽度为1.5 mm-2.5 mm;微流控芯片的所有通道的高度均为600-800μm。