[发明专利]一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法

说明书

本发明一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，主要步骤为：微流控芯片的制备；拟胚体EBs的形成；类脑在微流控芯片中的分化和发育。本发明构建的一种新型的工程化的三维类脑发育模型，是一种基于微流控芯片技术的可灌流的微反应器。本发明是将体内脑发育的基本原理和工程化技术结合，更好地模拟了脑早期发育的微环境。本发明具有成本低、操作简单、试剂用量少、可原位追踪和实时监测等优点，可替代动物模型和传统的二维培养方式，在一定程度上模拟脑早期的发育，为体外模拟脑发育、神经发育异常的病理学研究、药物筛选和毒性检测等方面提供了一个强有力的新平台。

技术领域

本发明涉及微流控芯片技术和组织工程的领域，具体涉及一种基于微流控芯片的类脑发育模型的构建方法。

背景技术

近几年来各种干细胞来源的类脑发育得到了有效发展，包括神经干细胞、肠干细胞、胚胎干细胞以及诱导多能干细胞iPSCs。类脑的形成来源于拟胚体EBs，是由干细胞特异性分化并自组装成具有三维结构的多细胞聚集体，在体外进一步发育成具有一定结构和功能特异性的组织，一定程度上模拟了相应脑的发育过程。研究表明iPSCs能定向分化成特异的细胞类型，并具有强大的自组装能力，能形成多种脑类型，目前已有的iPSCs来源的类脑包括肠，肾，视网膜和大脑等。iPSCs来源的类脑技术在模拟人体脑发生，药物筛选和细胞替代疗法以及疾病模型的建立和研究等方面提供了一个独特的平台，弥补了2D细胞培养分化以及动物模型存在种间差异的不足，具有广泛的应用前景。

大脑类脑(类脑)是指发育成的具有不同的独立脑区并相互连接的类脑，主要由大脑皮层构成，产生有特定空间分布结构的前体细胞和多种类型的皮层神经元。最近的研究表明，类脑技术主要是通过干细胞的定向诱导分化，以拟胚体形式自组装并利用基质包埋悬浮培养的方式形成有不同脑区和皮层的类脑。类脑在很大程度上概括了大脑早期发育的特征，可用来模拟大脑发育的过程，研究哺乳动物神经发育的基本机制。尽管这类技术有潜在的优势和应用，仍然面临很多局限和不足。首先，由于3D细胞团的结构特点，使得内部细胞由于缺少氧气和营养，出现中心细胞坏死现象，极大限制了类脑发育的程度，包括体积大小、功能成熟度等，而在生理情况下组织和脑中分布着血管网络用于提供充分的氧气和营养物质，是传统方法很难实现的。其次，传统方法中如使用旋转反应器培养类脑需要消耗大量的培养基和培养空间，成本较高并且可操作性不强，不利于施加不同的条件刺激。最后，传统方法主要是利用细胞自组装和化学因子诱导形成类脑，没有时空上的因素控制及物理因素的参与。因此，结合现有的工程化手段尤其是微流控技术，有望优化类脑技术。

微流控芯片作为细胞培养载体，有几大优势：首先，借助微流控芯片技术可根据实际应用设计不同的通道尺寸，提供一定的空间限制即物理因素控制，并维持细胞的三维生长状态。其次，流体控制有助于促进营养物质和氧气的交换，减少细胞凋亡或细胞团中心坏死现象，为细胞培养提供良好的生存环境。最后，PDMS作为微流控芯片的制作材料，具有良好的透光和透气性，可进行细胞的实时监测和观察并有利于细胞对氧气的充分利用，维持细胞的生长状态。但是目前将微流控技术与类脑技术相结合，优化体外类脑的发育及操作尚属空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，该方法高效地实现了类脑的生长、分化和发育，包括不同脑区和大脑皮层的分化形成。该微流控灌流系统通过三维细胞培养和流体控制等要素，模拟体内脑发育的微环境，不仅保证了发育过程中充分的营养物质和氧气的交换，同时实现了类似早期脑发育过程中的脑组织结构和空间排布形成，并具有低成本、易操作、可原位示踪和实时监测的特点，为模拟脑发育、脑病机制研究、药物筛选和测试提供了一个新的平台。

本发明提供了一种基于微流控芯片的三维类脑发育模型的构建方法，其步骤主要分为三部分：微流控芯片的制备、拟胚体EBs的形成和类脑在微流控芯片中的分化发育。

所述步骤(1)微流控芯片的制备，具体为：