[发明专利]一种蛹虫草线粒体基因型的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及线粒体基因型检测领域，具体涉及一种蛹虫草线粒体基因型的检测方法。

背景技术

蛹虫草(Cordyceps militaris)又叫北虫草或北冬虫夏草，是隶属子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌目、虫草科、虫草属的一种丝状真菌。现代研究证实，蛹虫草有抗肿瘤、抑制流感病毒、对辐射损伤的保护及抗炎等多种药理作用，目前已经在东亚地区被广泛作为滋补品及药用菌使用，并被用作冬虫夏草的替代品进行开发利用。2009年蛹虫草已被卫生部列为新资源食品(现名新食品原料)，因此蛹虫草可作为普通食品流通。目前，蛹虫草子实体已经实现了产业化生产，以蛹虫草为主要成分的保健食品已有近50种，药品有两种。蛹虫草在我国已经形成了一个巨大的产业，据估计年产值达100亿元人民币。尽管如此，市场上有些保健食品和药品只标称虫草，而未明确说明是哪种虫草；有的虽标称冬虫夏草，但实际可能为蛹虫草。

由于具有重要的经济价值，近年来人们陆续开展了蛹虫草多种组学水平的研究工作。目前，蛹虫草的核基因组和线粒体基因组均已公布，人们还开展了转录组、甲基化组和蛋白质组的研究。我们通过分析和比较不同蛹虫草菌株的线粒体基因组，发现不同的蛹虫草菌株表现出线粒体内含子的插入缺失多样性，从而具有不同的线粒体基因型(Scientific Reports 2017,7:40219)。同时，由于为异宗配合真菌，蛹虫草是研究真菌线粒体遗传机制的理想材料。然而，开展线粒体遗传机制的研究需要同时对大量蛹虫草菌株的线粒体基因型进行分析，常规的通过测序来确定线粒体基因型的方法由于成本较高、时间较长，无法满足该类研究的需要，亟需建立一种简单易行的快速检测线粒体基因型的技术体系。

根据目前已知的研究结果，蛹虫草在其线粒体基因组中至多有8个内含子插入位点(Scientific Reports 2017,7:40219)。本发明以这8个潜在内含子位点为靶标，建立基于PCR扩增和电泳分析的快速检测蛹虫草线粒体基因型的技术体系。该技术体系既可辅助用于蛹虫草遗传稳定性和遗传机制的研究，还可用于蛹虫草的真伪鉴别和工业生产蛹虫草菌株间的快速“亲子鉴定”。

发明内容

本发明的目的是建立一种蛹虫草线粒体基因型的快速检测方法。

为达到上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种蛹虫草线粒体基因型的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)利用已知线粒体基因型的蛹虫草菌株，设计扩增8个线粒体内含子位点的引物，通过PCR扩增分别得到在这些内含子插入位点有对应内含子的I类扩增产物和在这些潜在内含子位点缺失内含子的II类扩增产物；

(2)纯化各扩增产物并测定浓度后，将属于同类的扩增产物按相同质量混合在一起，分别进行琼脂糖凝胶电泳，制作成DNA分子量标准I和DNA分子量标准II；所述制作DNA分子量标准I的电泳条件：0.7％的琼脂糖凝胶，电压90V，时间120min；所述制作DNA分子量标准II的电泳条件：2.0％的琼脂糖凝胶，电压100V，时间60min；

(3)取待检测的蛹虫草菌株，利用与步骤(1)相同的引物进行PCR扩增，扩增产物分别按步骤(2)中DNA分子量标准I和DNA分子量标准II的琼脂糖凝胶电泳条件进行电泳，通过与DNA分子量标准I和DNA分子量标准II的比较，获知待检测的蛹虫草菌株的线粒体基因型。

所述的PCR扩增使用的引物分别为：CM-rnl-i1F1/CM-rnl-i1R1、CM-rnl-i2F1/CM-rnl-i2R1、CM-rnl-i3F1/CM-rnl-i3R1、CM-rnl-i4F1b/CM-rnl-i4R1b、CM-cob-F1/CM-cob-R1、CM-cox1-F1/CM-cox1-R1、CM-cox2-F1/CM-cox2-R1、CM-cox3-F1/CM-cox3-R1。

所述的已知线粒体基因型的蛹虫草菌株至少为V40-5和CM09-31-28或CM06。

所述的PCR扩增使用的DNA聚合酶为EasyTaq PCR SuperMix、KOD Plus Neo或KOD FXNeo。

上述技术方案中：

所有目前已知线粒体基因型的蛹虫草菌株见表1。

表1已经线粒体基因型的蛹虫草菌株

注：√代表某菌株在对应位点有内含子，×代表在对应位点缺失内含子。该表信息来源于Scientific Reports 2017,7:40219。