[发明专利]虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法

说明书

本发明公开了一种虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，包括如下步骤：1)、虾夷扇贝样品前处理，得样品液；2)、HLB/PDMS涂层搅拌棒的制备；3)、搅拌棒吸附萃取：先将HLB/PDMS涂层搅拌棒在甲醇中浸泡，然后置入5～10mL的样品液中，加酸调整pH值为3～7后进行富集；然后取出HLB/PDMS涂层搅拌棒放入乙腈中进行MCs解吸附，所得到的解吸附溶液用于液相色谱‑质谱分析；从而获得解吸附溶液中7种微囊藻毒素的浓度，最终获得虾夷扇贝样品7种微囊藻毒素的浓度。

技术领域

本发明涉及一种虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，属于生化分离技术领域，更具体涉及一种利用搅拌棒吸附分离虾夷扇贝中7种微囊藻毒素并利用超高效液相色谱-质谱分析对其定性、定量分析的方法。

背景技术

微囊藻毒素(Microcystins)为蓝藻水华释放的一类具有强烈致癌作用的肝毒素，其毒性较大，分布广泛，目前已发现异构体多约80余种，其结构由7个氨基酸组成，主要产自微囊藻(Microcystis aeruginosa)、鱼腥藻(Anabaena)、念珠藻(Nostocales)等浮游性蓝藻，其中MC-LR最为常见。调查表明，我国60％的水体由于过多接纳了氮和磷等营养物质而出现了蓝藻水华现象，该现象使水面湖靛堆积，大量消耗水中溶解氧致鱼类窒息死亡，藻体死亡分解过程中释放生物毒素类次级代谢产物，导致水体污染，水生动植物死亡。此外，已有研究证明，MCs进入人体肝细胞后，能强烈地抑制蛋白磷酸酶(PP1、PP2A)的活性，诱发细胞角蛋白高度磷酸化，导致肝细胞微丝分解、破裂和出血。因此，MCs通过食物链传递到水生动物中，并在水生动物体中积累富集而导致的人体健康潜在风险已经引起了国内外学者的普遍关注。因此建立一种淡水鱼肉中高效、准确、灵敏的MCs分析检测方法，对于水产品的质量安全与相关风险监测工作具有着重要意义。

目前，对于各种生物体中MCs的检测方法主要有酶联免疫(ELISA)法、聚合酶链式反应(PCR)、液相色谱(LC)法、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法等，其中LC-MS/MS方法通量较大，定性能力强，更适用于复杂基质中MCs的残留检测。

搅拌棒吸附萃取(SBSE)是一种新型的固相微萃取样品前处理技术，具有固定相体积大、萃取容量高、无需外加搅拌子、可避免竞争性吸附、能在自身搅拌的同时实现萃取富集等优点。目前广泛采用的涂层为非极性的聚二甲基硅氧烷(PDMS)，这种涂层结构致密，且高度疏水、化学性质稳定，适用于水相中非极性和弱极性化合物的萃取。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高的虾夷扇贝中微囊藻毒素的检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种虾夷扇贝中微囊藻毒素检测方法，包括如下步骤：

1)、虾夷扇贝样品前处理：

①、取1g待测虾夷扇贝肉进行匀浆；

②、在浆液中加入10～20mL甲醇后于80±5℃超声提取20～30min；

③、将超声提取所得物离心(冷冻离心机离心，即，控制温度为3～5℃)，取出上层清液；

④、以离心所得的沉淀替代步骤②中的浆液重复上述步骤②～步骤③的超声提取和离心；

⑤、将所有的上层清液合并后用氮气吹干，然后用5～10mL水复溶，得样品液；

2)、HLB/PDMS涂层搅拌棒的制备：

①、将搅拌棒清洗后烘干；

②、配制PDMS溶胶：

将100±5μL聚二甲基硅氧烷(PDMS)、100±5μL甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、10±1μL聚甲基氢硅氧烷(PMHS)和100±5μL 95％三氟乙酸(TFA)混合，得PDMS溶胶；