[发明专利]一种含血清的角膜上皮细胞培养液

说明书

本发明实施例提供一种含血清的角膜上皮细胞培养液，涉及生物医学领域。培养液1包括基础培养基、浓度为10%‑20%的胎牛血清，以及浓度为1‑10μM的细胞增殖分化调节因子维甲酸和甘醇酸；培养液2包括基础培养基、浓度为1%‑5%的胎牛血清，浓度为1‑5μM的细胞增殖分化的调节因子维甲酸、甘醇酸、Rock抑制剂Y27632和CaCl2，浓度为5‑15μg/ml的胰岛素和转铁蛋白，以及浓度为5‑20ng/ml的表皮生长因子EGF、胰岛素生长因子IGF‑I、转化生长因子TGFβ、牛垂体提取物BPE和贴壁因子纤连蛋白。能够满足原代角膜上皮细胞高密度增殖的需要，又避免了上皮细胞传代培养中过度分化而导致的细胞增殖抑制现象，有效的平衡了体外角膜上皮细胞的增殖及分化速度，降低了细胞的倍增时间，从而满足大规模的组织工程模型构建的需求。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种含血清的角膜上皮细胞培养液。

背景技术

角膜由外而内依次包括：上皮层、前弹力层(Bowman膜)、基质层、后弹力层(Decemet膜)和内皮层。角膜上皮层厚约 50～60 μm，占整个角膜厚度的10 %，角膜上皮细胞间以桥粒相互连接，构成致密坚固的质膜，成为角膜的第一道屏障。角膜上皮层具有保护眼球，稳定泪膜，维持角膜透明性等功能，是一种不断自我更新的组织。角膜上皮细胞的体外培养对研究角膜的生理学、病理学、免疫学以及分子生物学都是极为重要的手段，常用于细胞代谢产物、病毒感染、各种生长因子和药物对细胞生长的影响的研究。角膜上皮细胞的培养成功也为多种眼部疾病如眼表泪液病、无虹膜、化学和热烧伤、辐射损害、Stevens-Johnson综合征、眼瘢痕性天疱疮等的移植治疗开拓了广阔前景。另外，近年来随着体外器官培养技术的发展，利用体外培养的角膜上皮细胞来构建三维角膜模型，从而应用到体外化学品的眼刺激潜在危害性的评估，与其他的体外替代眼刺激评估方法相比，基于体外细胞培养构建的3D重组角膜上皮模型的眼刺激风险评价表现出特有的优势，首先体外构建的3D角膜模型更类似于人体角膜上皮的细胞三维结构，不仅可以更为真实的反映人体对化学物的响应，准确给出化学物刺激性的预测，而且化合物筛选的种类也具有更宽的应用范畴，不仅适用于化妆品原料的危害评价，还可以用于不同剂型的化妆品成品的危害评估。目前，角膜上皮细胞是构建体外三维角膜上皮组织模型最理想的种子细胞，构建的三维角膜模型的生物学特性更能反映真实的角膜组织。然而由于分化后的角膜上皮细胞体外生长的生命周期很短，只能传2～3代，获得的细胞数量少，花费较高，限制了角膜组织的研究和组织工程化角膜的构建。因此如何改进体外培养技术，培养出分裂增殖能力强、 能不断分裂生长的角膜上皮细胞，以补充细胞的不断更新，成为获得角膜上皮种子细胞的首要任务。

现如今，角膜上皮细胞的体外培养方法有组织块法和细胞悬液法。组织块法是直接将取到的角膜缘剪成大小均匀的组织块，上皮面朝下培养在载体膜表面，培养的角膜缘上皮细胞就会向外迁移扩增，最后形成一个组织薄片，它的优点在于培养出的细胞可以较好的保持其自身生物学特性，细胞生长旺盛；缺点在于培养过程中杂质细胞尤其是成纤维细胞的污染率较高。细胞悬液法是将取自角膜缘的组织经过消化酶如胰酶、DispaseⅡ酶等消化成单个细胞，配成细胞悬液，然后以3T3作为滋养层的技术来进行的，但由于滋养细胞的存在干扰检测试验结果的分析。而且，许多研究者相信3T3细胞和人细胞共同培养有可能引起突变或异种蛋白对人角质形成细胞（keratinocyte, KC）的转染，强调在移植手术中尽量不用滋养层培养上皮细胞。为了避免使用滋养层，人们开发了多种方法：如培养皿表面涂细胞基质成份；不同浓度的钙和各种生物提取物的添加；促分裂物和微量元素的添加。