[发明专利]一种防收缩的人工真皮构建方法

权利要求书

1.一种防收缩的人工真皮构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：成纤维细胞的分离培养

将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织进行消化培养，取第5~7代细胞用于真皮构建；

步骤二：胶原支架的制备

将胶原完全溶解于酸溶液中，将胶原溶解液、新生牛血清和DEME混匀，并调PH至7.2～7.4，得胶原溶液；

步骤三：真皮层的接种

取步骤一的成纤维细胞与步骤二中配置好的胶原溶液混匀，形成密度为6×105～9×105 cells/mL的细胞胶原混合液I；另取步骤一的成纤维细胞与步骤二中配置好的胶原溶液混匀，形成密度为2×105～3×105cells/mL的细胞胶原混合液II；将30~50μL的细胞胶原混合液II加入到Transwell小室中，待细胞胶原混合液II凝固后，将100~150μL的细胞胶原混合液I加入到混合液II表面；

步骤四：人工真皮的培养

待混合液I凝固后，将Transwell小室放入培养皿中，在Transwell小室内外均加入培养液，放入含4.5%-5.5% CO2、37±1℃培养箱中培养，得到所述人工真皮。

2.根据权利要求1所述的防收缩的人工真皮构建方法，其特征在于，步骤四所述在Transwell小室内外均加入的培养液为，包括体积比为3:1的DMEM和DMEM/F12的混合培养液，混合培养液中还添加有胎牛血清、NaHCO3、维生素C、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤和碱性成纤维细胞生长因子，所述培养液中胎牛血清的质量百分比为3～10％，所述NaHCO3的浓度为3～5mg/ml，所述维生素C的浓度为50～100mg/L，所述胰岛素的浓度为15～30ng/ml，所述氢化可的松的浓度为150～180ng/L，所述腺嘌呤的浓度为55～75μg/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8～12ng/ml。

3.根据权利要求2所述的防收缩的人工真皮构建方法，其特征在于，所述Traswell小室内加入所述培养液200 μL，所述Traswell小室外加入所述培养液120mL。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的防收缩的人工真皮构建方法，其特征在于，所述成纤维细胞的分离培养方法为：将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织置于培养液I中，放置于4℃过夜；加入与培养液I等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；以每毫升2×105～4×105个细胞接种于培养液Ⅱ，5％CO2、37℃条件下培养；

所述培养液I为DMEM，其中还添加有胶原酶、透明质酸、谷氨酰胺、孕酮、丁二胺、硒酸钠和转铁蛋白，所述培养液I中各添加元素的浓度为：胶原酶200U•mL-1、透明质酸300U•mL-1、谷氨酰胺2～10mM、孕酮10～20nM、丁二胺30～60μM、硒酸钠15～30nM、转铁蛋白65～100ng/mL；

所述消化液为磷酸盐缓冲液PBS，其中还含有0.25％体积的胰酶和0.02％体积的乙二胺四乙酸EDTA；

所述培养液II为10％体积的胎牛血清和90％体积的DMEM的混合液。

5.根据权利要求1-3中任意一项所述的防收缩的人工真皮构建方法，其特征在于，所述胶原支架的制备方法为：将牛胶原置于0.1%醋酸溶液中，搅拌至胶原完全溶解后，置于4℃冰箱静置过夜；然后以胶原溶解液：新生牛血清：10×DEME=1：1：8的体积比混匀后，加入碱溶液，调PH至7.2～7.4即得。