[发明专利]一种防收缩的人工真皮构建方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种防收缩的人工真皮构建方法。

背景技术

1987年，在华盛顿举办的生物工程小组会上，组织工程一词首次被提出。后于1988年正式被定义为：应用生命科学与工程学原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构和功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。

皮肤组织工程是组织工程的重要组成部分，它是将体外培养的皮肤种子细胞（主要是角质形成细胞和成纤维细胞），与由天然细胞外基质复合或合成的可降解生物相容性材料相结合，形成的细胞-材料复合物，在体外进行一段时间的培养后，用于临床治疗或药品、化妆品等的体外替代检测。

真皮层的构建是构建组织工程皮肤中的重要环节。目前，真皮组织体外构建的方法主要是将成纤维细胞接种于天然的（胶原等细胞外基质）或人工的（聚乙交酯、聚己内酯、聚羟基烷酸酯等）真皮支架中，经过培养后，构成真皮层。以胶原等细胞外基质为支架构成的真皮替代物的组织学表现更接近正常真皮，并且避免了加入合成聚合体和交联剂可能导致的未知毒性，同时还具有生产皮肤替代物所必需的细胞数量相对较少等优点，因此在临床与体外替代检测领域应用广泛。

利用胶原作为支架材料构建的人工真皮仍然存在一些技术缺陷，现有技术在胶原支架上接种成纤维细胞时，是一步接种，得到的真皮容易产生收缩，这严重影响了人工真皮替代物在临床以及体外替代检测领域的应用。

发明内容

针对人工真皮构建过程中易收缩这一技术不足，本发明提供了一种防皱缩的人工真皮构建方法，采用差异化接种的方式，使人工真皮的上层细胞密度相对较大，可以满足检测需要的细胞数目；下层密度相对较小，可以减少细胞生长过程中对胶原基质的利用，从而实现减少下层真皮收缩的目的。

本发明所采用的技术方案是，一种防收缩的人工真皮构建方法，包括以下步骤：

步骤一：成纤维细胞的分离培养

将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织进行消化培养，取第5~7代细胞用于真皮构建；

步骤二：胶原支架的制备

将胶原完全溶解于酸溶液中，将胶原溶解液、新生牛血清和DEME混匀，并调PH至7.2～7.4，得胶原溶液；

步骤三：真皮层的接种

取步骤一的成纤维细胞与步骤二中配置好的胶原溶液混匀，形成密度为6×105～9×105 cells/mL的细胞胶原混合液I；另取步骤一的成纤维细胞与步骤二中配置好的胶原溶液混匀，形成密度为2×105～3×105 cells/mL的细胞胶原混合液II；将30~50μL的细胞胶原混合液II加入到Transwell小室中，待细胞胶原混合液II凝固后，将100~150μL的细胞胶原混合液I加入到混合液II表面；

步骤四：人工真皮的培养

待混合液I凝固后，将Transwell小室放入培养皿中，在Transwell小室内外均加入培养液，放入含4.5%-5.5% CO2、37±1℃培养箱中培养，得到所述人工真皮。

优选地，步骤四所述在Transwell小室内外均加入的培养液为，包括体积比为3:1的DMEM和DMEM/F12的混合培养液，混合培养液中还添加有胎牛血清、NaHCO3、维生素C、胰岛素、氢化可的松、腺嘌呤和碱性成纤维细胞生长因子，所述培养液中胎牛血清的质量百分比为3～10％，所述NaHCO3的浓度为3～5mg/ml，所述维生素C的浓度为50～100mg/L，所述胰岛素的浓度为15～30ng/ml，所述氢化可的松的浓度为150～180ng/L，所述腺嘌呤的浓度为55～75μg/ml，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为8～12ng/ml。

进一步地，所述Traswell小室内加入所述培养液200μL，所述Traswell小室外加入所述培养液120mL。

优选地，成纤维细胞的分离培养方法为：将已去除脂肪和结缔组织的皮肤组织置于培养液I中，放置于4℃过夜；加入与培养液I等体积的消化液，37℃空气摇床180rpm 20min后终止消化；1000rpm离心10min收集细胞；以每毫升2×105～4×105个细胞接种于培养液Ⅱ，5％CO2、37℃条件下培养；