[发明专利]一种屏障加强的体外重组表皮模型的构建方法

权利要求书

1.一种屏障加强的体外重组表皮模型的构建方法，其特征在于，该方法包括如下几个步骤：

步骤一、表皮干细胞分离和培养：

将人体皮肤组织置于培养皿中，加入75%酒精10mL，迅速进行冲洗，转入PBS溶液中，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，用PBS浸洗，将组织块切成0.3cm×0.5cm的大小，加入15ml质量比为1%的Dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，再加入10ml质量比为0 .025%的EDTA-胰酶消化液，37℃消化10分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，用200目不锈钢筛网过滤表皮碎片，1000rpm离心7分钟，去掉上层清液，用PBS洗涤下层细胞，然后1000rpm离心7分钟，倒掉上清液，加入表皮细胞培养液，按2～4×10⁶/瓶接种到IV型胶原包被的培养瓶中，37℃，5% CO₂培养箱中孵育10～15min，吸出培养基，更换新鲜表皮细胞培养液继续培养，隔48h换一次液；

步骤二、组织工程表皮构建：

将步骤一中获得的表皮干细胞用胰酶消化液消化，用表皮细胞TU培养液制成密度为1×10⁶～6×10⁶个/ml的表皮干细胞分散液，取200μl接种于含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，震荡均匀，在37℃，5% CO₂培养箱中孵育20～30min；将接种后的细胞培养小室转入表皮模型培养模具中，小室外的培养皿中加入新鲜表皮细胞TU培养液，37℃，5% CO₂培养箱继续培养24～48h后，吸去细胞小室中的剩余培养基，将细胞培养小室升至气液面，更换表皮细胞TA培养液，37℃ 5% CO₂培养箱继续培养12～14天后可得具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、角质层的组织工程表皮模型；

所述表皮细胞TU培养液是在无血清细胞培养液MCDB153基础上每500ml中添加表皮生长因子0 .5～5μg、氢化可的松2～50μg、胰岛素1～10mg、腺嘌呤 5～25mg、转铁蛋白2 .5～6μg、氯化钙0 .03～0 .2mM配置的；所述表皮细胞TA培养液是在所述TU培养液基础上，每500ml中添加脂质混合物、巨噬细胞活化肽MALP-2 2.5～5.0mg、维生素C 15～25μg，并调整氯化钙的浓度为1 .0～1 .5mM配置的；所述脂质混合物包括L-丝氨酸0 .25～5mM、棕榈酸0.4～5μM、亚油酸 0 .01～0 .05mM、精氨琥珀酸0 .025～0 .05 mM、牛血清白蛋白0.01～0.05mM。