[发明专利]一种屏障加强的体外重组表皮模型的构建方法

说明书

本发明提供一种屏障加强的体外重组表皮模型的构建方法，涉及组织工程技术领域，能够从化学组成及物理结构两方面加强组织工程重建表皮模型的屏障功能，满足皮肤吸收和渗透试验要求，扩大了产品的应用范围。该方法包括：步骤一、表皮干细胞分离和培养：步骤二、组织工程表皮构建，以形成具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、角质层的组织工程表皮模型。

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种屏障加强的体外重组表皮模型的构建方法。

背景技术

皮肤是人体与外界环境接触的屏障，保护体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物的侵袭。人体皮肤主要由三部分构成，即表皮层、真皮层和皮下组织。表皮层位于皮肤的最外层，由基底层、棘细胞层、颗粒细胞层和角质层构成。角质层是表皮细胞分化的最后产物，由角质形成细胞及其细胞间脂质基质组成，厚度大约为10μm，是皮肤屏障功能的主要结构，因此角质层的屏障功能一直是组织工程皮肤的主要研究课题，很多研究者在如何提高组织工程皮肤模型角质层屏障方面付诸了大量努力。

近年来，有越来越多的证据表明细胞紧密连接对维持机体表皮正常结构及功能具有重要作用，承担着部分皮肤屏障功能。紧密连接是一种细胞与细胞之间的连接结构，它的主要功能是：将表皮细胞紧密连接，使细胞不易受到破坏；控制分子的细胞旁通路，对分子大小、离子类型、细胞渗透性有选择性，具有细胞间透过屏障功能；维持细胞的极性，分离细胞膜基底部分和胞膜顶部的脂质；紧密连接蛋白还参与信号转导通路；此外，紧密连接可能还参与表皮钙离子梯度（Ca²⁺）形成和板层小体的极性分泌过程，是皮肤屏障功能的重要组成部分和关键调节因子。

现有的组织工程皮肤模型产品虽然在一般的结构、组成和生物化学方面与人类皮肤具有高度相似性，可用于皮肤毒性测试，但其渗透性相比于人类皮肤仍然要高得多。造成模型屏障功能缺陷的因素除了脂质组成和板层结构上的异常外，可能还有细胞间连接结构的不完整 ，角质层正常脱落过程受损和非角化的微观病灶的存在，这些方面的缺陷导致现有的重组表皮模型屏障功能不完善，限制了这些皮肤模型在皮肤吸收和渗透实验等其他方面的应用。

具有成纤维细胞真皮层和表皮层的全层皮肤模型虽然在组织结构上更类似于人体天然皮肤，并且能在一定程度上降低渗透性，但真皮层的加入又会引入其他影响，如在模型制备过程中，下层成纤维细胞的来源，数量以及状态的差异性对于表皮细胞的增殖及分化有较大影响，造成模型稳定性差，影响模型对化学物质评判的准确性。另外由于成纤维细胞在体外分化的过程中，会自身分泌的胶原，对外界的胶原支架或者其他生物材料支架进行塑形，易导致真皮部分乃至模型收缩，引起测试物从模型边缘的渗漏，干扰测试结果的评判；最后，成纤维细胞的存在也要求构建体系的培养液必须含有血清，引进了不可预估的安全风险。并且，模型构建工艺繁琐，制备周期长，结构复杂。

发明内容

本发明提供了一种屏障加强的体外重组表皮模型的构建方法，能够从两方面加强组织工程重建表皮模型的屏障功能，满足皮肤吸收和渗透试验要求，扩大了产品的应用范围。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供过一种屏障加强的体外重组表皮模型的构建方法，该方法包括以下步骤：

1、表皮模型构建培养基配制：

（1）表皮细胞培养液配制：以KC-growth培养液为基础液，每500ml中添加L-谷氨酰胺1.0~1.5mM和牛垂体提取物12~25mg。

（2）表皮细胞TU培养液：在（1）的基础上添加表皮生长因子0.5~5μg、氢化可的松2~50μg、胰岛素1~10mg、腺嘌呤 5~25mg、转铁蛋白2.5~6μg、氯化钙0.03~0.2mM。