[发明专利]一株适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法

权利要求书

1.选育出的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，是在酿酒酵母出发菌株中醇乙酰基转移酶编码基因ATF1的5’端通过两步重组无缝精确插入弱化的PGK1强启动子获得。

2.如权利要求1所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315。

3.如权利要求1所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母具有正常的生长性能并且用于正常的发酵性能以及产酒精能力，在30℃玉米原料浓醪发酵中乙酸乙酯产量相对亲本菌株提高了53％，相对于插入全长的PGK1启动子的菌株降低了30％。

4.如权利要求1所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法是通过融合PCR技术和整合型载体质粒YIplac211介导的两步基因整合法，把强启动子PGK1的3’端-300bp至-100bp(ATG＝+1)这一序列无痕敲除来实现。

5.如权利要求4所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，具体步骤包括：

用PCR方法获得突变ura3片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组实现出发菌株的URA3基因突变；

用PCR方法分别扩增1047bp的上游同源臂序列，弱化的PGK1启动子序列以及1046bp的下同源臂序列，然后通过融合PCR，分别将三段序列融合成无缝片段；将该片段克隆至酵母整合质粒YIplac211上，获得能够进行整合敲除的质粒；

在整合敲除质粒的上游同源臂或者下游同源臂中，选择合适的单一酶切位点，将质粒酶切线性化；

通过醋酸锂化学转化法，将线性化的整合敲除质粒导入酿酒酵母中，用不含尿嘧啶的酵母合成培养基筛选发生第一步整合重组的酵母突变株；将经过鉴定的发生第一步整合重组的酵母突变株，经含有5-氟乳清酸合成培养基平板反向筛选获得发生第二步整合重组的酵母突变株；

用二步整合重组的酵母突变株和URA3基因正常的α型菌株在KAC培养基进行杂交产孢，然后分出正常的a型酵母突变菌株，以此方法回复突变的ura3标记基因。

6.如权利要求2所述的适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株在白酒生产中的应用。