[发明专利]一株适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一株适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术：

乙酸乙酯为白酒中含量最多的风味物质之一，在白酒中呈现出令人愉悦的果香气，乙酸乙酯是我国白酒的主体酯类之一，在浓香型及酱香型酒中分别还有相当量的乳酸乙酯，己酸乙酯及少量的丁酸乙酯，这四大酯在不同香型的酒占到总酯的90％～95％，构成了我国名优白酒的主体香，此外还有少量的乙酸异戊酯和乙酸异丁酯等。酯类含量变化对白酒风味有着决定性的影响。白酒中酯类含量过高或过低都会对风味产生不良影响，含量过低，白酒香味不足，酒精味重，不适宜饮用，且容易带来饮后上头的问题；酯类含量过高，会产生青草味，脂肪臭等不愉快气味。由于乙酸乙酯含量相对较多，容易检测，因此，控制白酒中的乙酸乙酯从而控制白酒中的总酯在适量的范围内，使得酯在白酒风味中发挥积极作用。

对于调节酿酒酵母中乙酸乙酯的合成，ATF1基因其中关键性作用，ATF1基因编码的醇乙酰转移酶AATaseI是催化合成乙酸乙酯的关键酶。研究发现使用强启动子PGK1等过表达 ATF1基因可以构建高产乙酸酯的酿酒酵母菌株(含量可以提高2-10倍)，而且，敲出ATF1 基因会导致最终的发酵产物中的乙酸酯含量减少。这些突变株所发酵的最终产物中乙酸酯含量可以通过启动子工程改变但不影响菌株的生长性能和基本发酵性。

醇乙酰转移酶的酶活力的改变会影响酵母细胞产乙酸酯的能力。通过对ATF1基因的表达调控，实现酿酒酵母细胞在最终的发酵产物中酯的改变。改变目的基因的启动子强度是实现基因表达调控的重要方法。采用融合PCR方法可以实现基因片段的精确无缝拼接，而且不受酶切位点的限制避免重复操作所带来的未知影响。该方法利用融合PCR和整合型载体质粒 YIplac211介导的两步整合方法，在无外源基因残留的前提下，实现对3’端不同程度敲的PGK1 启动子序列无缝插入到ATF1基因序列的5’端。构建的工程菌株可以安全应运到酿酒生产中，同时融合PCR介导的两步整合方法和启动子截断调控目的基因表达的方法可以广泛应运到酵母以及其他微生物的基因表达调控，促进了基因表达调控的发展。

发明内容：

本发明解决的技术问题是提供一株适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株及其构建方法。获得适量产乙酸乙酯酿酒酵母菌株的出发酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315，保存于中国工业微生物菌种保藏管理中心，公众可购买获得。

所述适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株在正常的生长性能和发酵性能不受影响的情况下，在30℃静止玉米浓醪发酵约84小时产生的乙酸乙酯相对于发菌株提高了53％，相对于插入全长的PGK1启动子的菌株降低了30％

所述适量产乙酸乙酯的酿酒酵母菌株具体可以在出发菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC32315的ATF1基因5’端插入截断的强启动子(截断PGK1启动子的-300bp 至-100bp，ATG＝+1)来实现。

上述基因无痕敲除可以用以下方法实现。各步骤所涉及具体操作方法参考现有文献报道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995。

用PCR方法获得突变ura3片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组实现出发菌株的URA3基因突变；

用PCR方法分别扩增1047bp的上游同源臂序列，弱化的PGK1启动子序列以及1046bp 的下同源臂序列，然后通过融合PCR，分别将三段序列融合成无缝片段；将该片段克隆至酵母整合质粒YIplac211上，获得能够进行整合敲除的质粒；

在整合敲除质粒的上游同源臂或者下游同源臂中，选择合适的单一酶切位点，将质粒酶切线性化；

通过醋酸锂化学转化法，将线性化的整合敲除质粒导入酿酒酵母中，用不含尿嘧啶的酵母合成培养基筛选发生第一步整合重组的酵母突变株；将经过鉴定的发生第一步整合重组的酵母突变株，经含有5-氟乳清酸合成培养基平板反向筛选获得发生第二步整合重组的酵母突变株；

用二步整合重组的酵母突变株和URA3基因正常的α型菌株在KAG培养基进行杂交产孢，然后分出正常的a型酵母突变菌株，以此方法回复突变的ura3标记基因。

本发明所述酿酒酵母菌株可应用于白酒发酵生产中。