[发明专利]还原性糖链的靶板衍生化和MALDI-TOF-MS分析方法

说明书

本发明属于糖生物技术领域，具体涉及一种还原性糖链的靶板衍生化方法，其包括以下步骤：分别配制还原性糖链溶液、吉拉德试剂T溶液和基质DHB的溶液，分别取基质DHB的溶液、还原性糖链溶液、吉拉德试剂T溶液，依次点在MALDI‑TOF‑MS仪器靶板的同一点上；点样后的靶板在室温下放置，直至样品点完全干燥。本发明还提供了对衍生化后的样品进行MALDI‑TOF‑MS分析的方法。本发明的还原性糖链的靶板衍生化及MALDI‑TOF‑MS分析方法，衍生化效率高，且可以有效防止酸性糖链降解，对中性糖链和酸性糖链均可以在正离子模式下进行检测，不需要切换，通用性强，更加简捷、高效。

技术领域

本发明属于糖生物学技术领域，具体涉及一种还原性糖链的靶板衍生化和MALDI-TOF-MS分析方法。

背景技术

糖类物质作为构建生命体的第三类生物大分子，具有十分重要生物学功能，如为生物体提供能量物质，是构成植物细胞壁的主要组成部分，在细胞的分化、发育、肿瘤的发生与细胞间的信号转导、识别、免疫应答等发挥着重要的作用。糖基化是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰之一，在蛋白质翻译调控、蛋白质降解等过程中起着非常重要的作用。50％以上的蛋白质以糖蛋白的形式存在，并且越来越多的研究表明，糖基化异常可导致人类疾病。在临床治疗过程中，使用的抗体药物均带有糖基化。

目前，大量的研究表明，糖蛋白上的糖链的异常变化和许多疾病有关，因此以研究糖链的结构和功能为主要内容的功能糖组学吸引了生命科学领域广泛的关注，尤其是以糖链作为研究对象来筛选癌症血清标志物的研究，为人类癌症的早期诊断、预后、治疗、反应预测和群体筛查开辟了新的途径，例如，糖蛋白的糖链末端常常会发生唾液酸化修饰，它不仅可稳定糖链结构，而且与许多恶性疾病的发生发展密切相关；因此对糖链结构进行解析显得十分的重要。

随着对糖类物质的研究的深入，生物质谱技术尤其是MALDI-TOF-MS技术在糖类物质的结构分析中起着重要的作用。由于它具有“软电离”、广泛的检测范围等优点，已经成为糖类检测分析中不可或缺的工具。但是由于生物来源的糖类物质含量少、结构复杂、不均一性及糖链的微量表达，造成在质谱检测中一些低丰度糖链及糖链上一些不稳定功能基团如唾液酸基团信号的丢失，给糖链的结构解析带来很大的困难。

衍生化技术通过给糖链C-1端半缩醛结构带上疏水性化学基团，改善糖链结构的疏水性，提高糖类物质的离子化效率，进而可提高糖类物质在MALDI-TOF-MS检测分析中的灵敏度。因此，衍生化技术越来越广泛的应用在糖链的MALDI-TOF-MS检测分析中。

目前针对还原性糖链C-1末端醛基的柱前衍生化技术主要有：(1)还原胺化法，此类反应需在酸性、加热(60℃～85℃)条件下进行，易造成唾液酸丢失；并且在催化剂的作用下才能发生反应，衍生化后需要对样品进行除盐纯化等步骤，且不适用于酸性糖链；(2)与吡唑啉酮的碱性缩合反应，此类反应需要在碱性、加热(65℃～75℃)条件下进行，且衍生化后样品也需经纯化处理；(3)肼类试剂成腙反应：此类反应条件相比于前两种方法温和，在弱酸性条件下就可以发生反应，目前常用的衍生化试剂主要有苯肼等。但是，此反应的衍生化效率不够高，较多类型的糖链不能被充分衍生化，后期的检测灵敏度下降。

可以得知，检测前的常规衍生化方法，一方面都具有反应后需纯化、富集处理，才可以进行检测，步骤过于繁杂，衍生化效率不高等缺陷，不利于提高实验效率。另一方面反应过程中一般需要加热，因此，对于酸性糖链来说，在衍生化过程中酸性基团，例如唾液酸易丢失，造成样品大量损失，后续检测灵敏度不高，因此，化学衍生化法用于生物来源糖链的分析和检测仍需改进。

目前，已有研究公开了还原性糖链的靶板衍生化MALDI-TOF-MS分析方法，利用样品在靶板上点样和衍生化过程同时完成，简化了MALDI-TOF-MS分析检测程序。