[发明专利]一种从牛血中提取SOD的方法

说明书

技术领域

本发明属于天然药物提取技术领域，尤其是一种从牛血中提取SOD的方法。

背景技术

SOD是Super Oxide Dismutase缩写，中文名称超氧化物歧化酶，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等；SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质，SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种，它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。

目前，从动物血液中提取SOD的方法有很多，其中专利CN201010241815.0公开了一种大规模工业化从牛、羊血液中提取超氧化物歧化酶的方法，将新鲜的牛血液或羊血液经过抗凝、低渗溶血、超滤、通过带有热源/冷源的搅拌机快速升降温、沉淀、3级温度处理：第一级：45-55℃；第二级：55-60℃；第三级：60-65℃、盐析、超滤及浓缩、冷冻干燥等生产步骤处理后得到纯度较高的SOD，但提取过程过于复杂，耗时长，成本高。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种从牛血中提取SOD的方法。

具体是通过以下技术方案得以实现的：

一种从牛血中提取SOD的方法，包括以下步骤：

(1)预处理：取新鲜牛血，加入抗凝剂搅拌破碎，离心得红细胞；

(2)清洗：采用0.1～0.5％的生理盐水清洗红细胞，洗涤1～3次；

(3)溶血：洗涤后加入溶膜剂，调节温度并搅拌，再放入超声波中处理20～30s，得溶血液；

(4)加热：溶血液中添加氯化铜和氯化锌，搅拌均匀，离心后得到粗提液；

(5)一次离心：将粗提液加入0.3～0.4倍体积的氯仿-乙醇混合搅拌，离心弃沉淀，得到粗酶液；

(6)二次离心：向粗酶液中加入0.6～0.8倍体积的溶剂，离心取上清液；

(7)冷冻干燥：将上述上清液进行离心，得到沉淀加入缓冲液溶解，脱盐后冷冻干燥即可。

所述抗凝剂为柠檬酸、肝素、EDTA、枸橼酸盐、草酸钾中任一种。

所述溶膜剂的加入量为溶血液体积的15～20％。

所述溶膜剂按体积计算为10～20％的甲苯、5～10％的四氯化碳、余量为蛋清的混合液，

所述步骤(3)中调节温度分为两个阶段，第一阶段控制温度为-10～-2℃，持续时间为8～10h，第二阶段控制温度为70～80℃，持续时间为6～8h。

所述氯化铜的用量为溶血液体积的2～3％，氯化锌的用量为溶血液体积的1～2％。

所述超声波的处理频率为20～30KHz。

所述溶剂为浓度75～80％的硫酸铵溶液。

本发明有益效果：

本发明中通过加入一定的溶膜剂，能够克服采用机械方式破碎效果不佳的弊端，同时结合两段温度的控制，使得蛋白质的活性受到抑制，在结合超声波的处理，进而使得红细胞膜膜能够完全被破碎，促使SOD能够从红细胞中溶出，提高SOD的提取率；本发明采用氯仿-乙醇和硫酸铵溶液进行两次离心，提高SOD的分离纯化效果；因为有机溶剂的使用容易造成SOD中铜离子和锌离子的丧失，导致蛋白质的结构发生变化，通过添加氯化铜和氯化锌后，可以为SOD补充铜离子和锌离子，使Cu-Zn-SOD的结构稳定，进而保证SOD的酶活性。

本发明通过预处理、清洗、溶血、一次离心、二次离心、冷冻干燥共六个步骤完成牛血SOD的提取，工艺简单、提取效果显著、产品纯度高。

具体实施方式

下面结核具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。

实施例1

一种从牛血中提取SOD的方法，包括以下步骤：

(1)预处理：取新鲜牛血，加入抗凝剂搅拌破碎，离心得红细胞；

(2)清洗：采用0.1％的生理盐水清洗红细胞，洗涤1次；

(3)溶血：洗涤后加入溶膜剂，调节温度并搅拌，再放入超声波中处理20s，得溶血液；

(4)加热：溶血液中添加氯化铜和氯化锌，搅拌均匀，离心后得到粗提液；

(5)一次离心：将粗提液加入0.3倍体积的氯仿-乙醇混合搅拌，离心弃沉淀，得到粗酶液；

(6)二次离心：向粗酶液中加入0.6倍体积的溶剂，离心取上清液；