[发明专利]一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母及构建方法。

背景技术

抗菌肽是一种小分子短肽，具有广谱抗菌性， 一般由小于 60 个氨基酸残基组成，由于分子量小，因此可以在水中溶解，高温下不易分解， 抗菌肽是在诱导条件下，动物免疫系统产生的一类防御性肽类物质，是免疫防御系统的重要组成部分。

PF1最早是科研人员从猪小肠中发现的，是 Cathelicidin 抗菌肽家庭中富含精氨酸和脯氨酸的线状抗菌肽，分子量约为 9KDa，主要含 42 个脯氨酸残基和 15个苯丙氨酸残基，是一种高抗菌活性，相对稳定的抗菌肽。

发明内容

本发明其目的就在于提供一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母及构建方法，使用乳酸克鲁维酵母对猪小肠抗菌肽 PF1进行表达，同时表达产物分泌胞外，降低了后续的分离纯化成本。

为实现上述目的而采取的技术方案是，

一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母，所述重组乳酸克鲁维酵母为PF1-pKLAC2-GG799。

一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母的构建方法，包括如下步骤：

（1）按乳酸克鲁维酵母密码子优化合成猪小肠抗菌肽PF1基因；

（2）将猪小肠抗菌肽PF1基因与乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2同时双酶切反应、琼脂糖凝胶电泳回收，并进行4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109，提重组质粒PF1-pKLAC2；

（3）使用限制性内切酶SacII线性化处理重组质粒；

（4）线性化重组质粒转化乳酸克鲁维酵母 GG799,构建重组乳酸克鲁维酵母PF1-pKLAC2-GG799。

有益效果

与现有技术相比本发明具有以下优点。

本发明的优点是使用乳酸克鲁维酵母对猪小肠抗菌肽PF1进行表达，同时表达产物分泌胞外，降低了后续的分离纯化成本，因此具有更广阔的应用前景。

附图说明

以下结合附图对本发明作进一步详述。

图1为猪小肠抗菌肽 PF1 基因与 pKLAC2 质粒连接的阳性转化子 PCR 鉴定电泳图（引物 PF1-F 和 PF1-R，产物约 267bp）；

图2为乳酸克鲁维酵母 GG799 表达 PF1 的 SDS-PAGE 图（蛋白大小在 9KD 左右）；

图3为 pKLAC2 质粒图谱；

图4为 pKLAC2 质粒的多克隆位点图谱。

具体实施方式

一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母，所述重组乳酸克鲁维酵母为PF1-pKLAC2-GG799。

所述基因的乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2。

所述质粒的乳酸克鲁维酵母为GG799。

一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母的构建方法，如图1-4所示，包括如下步骤：

（1）按乳酸克鲁维酵母密码子优化合成猪小肠抗菌肽PF1基因；

（2）将猪小肠抗菌肽PF1基因与乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2同时双酶切反应、琼脂糖凝胶电泳回收，并进行4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109，提重组质粒PF1-pKLAC2；

（3）使用限制性内切酶SacII线性化处理重组质粒；

（4）线性化重组质粒转化乳酸克鲁维酵母 GG799,构建重组乳酸克鲁维酵母PF1-pKLAC2-GG799。

实施例 1

PF1基因的获得

抗菌肽PF1的氨基酸序列为：

AFPPPNVPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPPFPPPIFPGPWFPPPPPFRPPPFGPPRFP

按乳酸克鲁维酵母密码子偏好性优化，两端分别添加酶切位点 NcoI 和EcoRI及酶切位点保护性碱基， 并在上游添加 6 个组氨酸的核苷酸序列，优化好的序列为：