[发明专利]一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型及其构建方法

权利要求书

1.一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：以人源性RS1基因为基础，筛选人类致病基因通过基因编辑手段敲入到小鼠中，得到具有和病人临床表征一样的RS1h-KI小鼠疾病模型。

2.根据权利要求1所述的一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：运用TALENs的技术，根据XLRS病患筛选得到RS1基因的突变位点，设计与XLRS病患相同的Oligo序列，构建好的载体，转入细胞中，筛选得到具有RS1基因突变的稳定细胞系,体外表达，分离得到mRNA，并进行受精卵显微注射及胚胎移植到F0代的孕鼠子宫中，繁殖得到稳定表型的F1代RS1h-KI 疾病模型小鼠。

3.根据权利要求2所述的一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：Oligo序列为：TGGGTGTTTGAGTGTGTGCTGTTTTTCCTCCCCAGAATGCCCATATCACAAGCCCCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACGCCAGATCA。

4.根据权利要求2所述的一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：突变型RS1基因翻译的蛋白质序列：MPHKIEGFFLLLLFGYEATLGLSSTEDEGEDPWYQKACKCDCQVGANALWSAGATSLDCIPECP。

5.根据权利要求2所述的一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：用TALEN构建基因敲入小鼠，设计针对RS1基因的第四个外显子上c.195 T>G的突变位点，利用TALEN的两个手架让TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合，形成FokI二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂，从而诱发DNA损伤修复机制，细胞通过非同源性末端接合机制修复DNA，达到基因敲入到小鼠的基因中，TALEN的两个手架：TALEN_Left引物为：TGACTCGAAACCCAGGGG；TALEN_Right引物为：TGCCCATATCACAAG；Spacer区域为：TGCCCATATCACAAG。

6.根据权利要求5所述的一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：针对RS1基因的第四个外显子上c.195 T>G的突变位点，设计基因敲入的Oligo 序列为：TGGGTGTTTGAGTGTGTGCTGTTTTTCCTCCCCAGAATGCCCATATCACAAGCCCCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACGCCAGATCA。

7.根据权利要求5所述的一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：在RS1基因的215bp处设置一个Bpu10I酶切位点。

8.根据权利要求2所述的一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：设计构建好的人源性RS1基因Oligo 序列，将其进行体外转录，采用显微注射的方式将体外转录的mRNA注射入C57BL/6J成熟卵细胞中，注射成功的受精卵可体外培养过夜或立即转入代孕母鼠子宫中受孕培养。

9.根据权利要求2所述的一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：代孕母鼠产仔后，取F1代小鼠的尾巴和脚趾，提取全基因组，进行PCR扩增，Bpu10I酶切酶切验证，测序鉴定。

10.一种根据权利要求1所述的人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型，其特征在于：RS1h-KI小鼠基因测序序列:CATTATCTCTGTTGAGTTCTGGGATAGGAGGGGTTCATTCCTTCTTTTGTATTTTGGGATGAGGTCTCAATACTTTCTCCGGACAGCCCAGAGAAGCTGGGACTCCACACTGTGAACATATGCTACCACTCTGCCTGGAGATTTGGGTGTTTGAGTGTGTGCTGTTTTTCCTCCCCAGAATGCCCTTAGCACAAGCCCCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACGCCAGATCAGATCACTTGCTCCAACCCAGAGCAGTATGTGGGCGGTATTCCTCCA。