[发明专利]一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型及其构建方法。

背景技术

遗传性视网膜劈裂症是一种X 染色体遗传病，故又称为X连锁视网膜劈裂症（X-linked retinoschisis, XLRS）。该病在白人、黑人和黄种人群中均有发生，其发病率为1:5000-1:25000。XLRS主要为男性发病，女性发病较为少见，遗传性者多见于儿童及青年人，是青少年致盲的主要遗传病之一。XLRS 临床症状多为黄斑部视网膜劈裂，斜视，眼球震颤，视力差甚至全盲，ERG呈现异常，b波幅度明显减小，OCT扫描显示明显的“窝轮状”囊腔劈裂，严重的表现为视网膜各层厚度和总厚度变薄。时至今日，遗传性视网膜劈裂症还无行之有效的治疗办法。

RS1基因的突变被认为是先天性视网膜劈裂症致病的遗传机制，RS1 基因定位于Xp22.2，由六个外显子构成，编码224个氨基酸。目前，已经有230 多个RS1基因突变位点的报道，这些基因的突变被认为是先天性视网膜劈裂症致病的遗传机制，而这些RS1基因突变的位点引起视网膜RS1蛋白的缺失或RS1蛋白功能的丧失，被认为是XLRS发病的关键因素，这些单基因突变的位点也成为了基因治疗过程中的重要锚定靶点。

正是基于对X 连锁视网膜劈裂症遗传机制的明确，人们利用RS1基因进行了相关疾病模型的构建。目前，全世界有3种RS1 基因敲除小鼠模型（RS1-KO）在最近十年中相继用于XLRS的研究。第一种是在RS1 的第3个外显子上插入LacZ/Neor形成空载小鼠模型。第二种是在RS1的第1个外显子上插入一个新霉素基因导致了RS1 蛋白不表达的小鼠模型。第三种是用亚硝基脲（N-ethyl-N-nitrosurea，ENU)处理得到随机突变的小鼠模型，主要得到的是在第2个外显子上的点突变和26个碱基缺失的小鼠模型。迄今为止，这些RS1-KO小鼠均是内源性小鼠疾病模型，其突变位点与病人基因的突变并不一样，所以这对后期临床的评价可能会有所偏差。研究也证实这些RS1敲除小鼠部分表现为XLRS患者的特征，包括b波幅度显著降低、视网膜出现劈裂、光感受器退化以及神经节细胞层和内核层变薄，但视网膜神经细胞层和内核层变薄，内网层出现劈裂等表征与人的视网膜劈裂临床症状存在着差异。有关人源性小鼠模型国际国内都未见报道，人源性突变的RS1基因转入小鼠形成的XLRS疾病模型是否具有与临床病患相类似或相同的表征也未见报道。开展人源性RS1h-KI疾病模型的研究，这能够更好更准确的模拟人类疾病发病过程，为研究XLRS提供更为精准和丰富的实验动物对象。

发明内容

本发明针对以上问题，提供一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型及其构建方法。

发明目的通过以下方案实现：一种人源性视网膜劈裂症转基因小鼠模型的构建方法，以人源性RS1基因为基础，筛选人类致病基因通过基因编辑手段敲入到小鼠中，得到具有和病人临床表征一样的RS1h-KI 小鼠疾病模型。

进一步的，运用TALENs的技术，根据XLRS病患筛选得到RS1基因的突变位点，设计与XLRS病患相同的Oligo序列，构建好的载体，转入细胞中，筛选得到具有RS1基因突变的稳定细胞系,体外表达，分离得到mRNA，并进行受精卵显微注射及胚胎移植到F0代的孕鼠子宫中，繁殖得到稳定表型的F1代RS1h-KI 疾病模型小鼠。

进一步的，Oligo序列为：TGGGTGTTTGAGTGTGTGCTGTTTTTCCTCCCCAGAATGCCCATATCACAAGCCCCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACGCCAGATCA。

进一步的，突变型RS1基因翻译的蛋白质序列：MPHKIEGFFLLLLFGYEATLGLSSTEDEGEDPWYQKACKCDCQVGANALWSAGATSLDCIPECP。