[发明专利]一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法及应用

权利要求书

1.一种基于自然转化的拟态弧菌遗传重组方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以拟态弧菌SCCF01株基因组为模板，使用目的基因上臂和目的基因下臂引物对扩增目的基因上臂序列和下臂序列；以PKD4质粒为模板，使用Kan引物对扩增卡那霉素抗性基因片段；

2)将扩增得到的卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段进行融合，得到含有卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段的融合PCR产物；

3)将步骤2)获得融合PCR产物与受体拟态弧菌SCCF01株进行自然转化，经过对抗性标记基因的筛选，获得拟态弧菌SCCF01株的缺失株；

步骤1)中的PCR扩增的反应体系均为：5×PrimeBuffer 10μl，dNTP Mixture 4μl，10μM特异性的引物对上、下游引物各1μl，模板1μl，2.5U/μlDNA Polymerase0.5μl，ddH₂O 32.5ul；

步骤1)中的PCR扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸150s共35个循环72℃延伸10min；

所述目的基因为TLH基因，其对应的目的基因上臂和目的基因下臂引物对分别是TLH-UP和TLH-DOWN引物对，所述TLH-UP引物对包括TLH-UP-F和TLH-UP-R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述TLH-DOWN引物对包括TLH-DOWN-F和TLH-DOWN-R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述Kan引物对包括Kan-F和Kan-R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；

步骤2)中的融合具体为：

第一步PCR反应体系：5×PrimeBuffer 5μl，dNTP Mixture 2μl，模板各1μl，模板包括卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段胶回收产物，2.5U/μlDNA Polymerase 0.25μl，ddH₂O 16ul；PCR反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸5min共20个循环，72℃延伸10min；

第二步PCR反应体系5×PrimeBuffer 10μl，dNTP Mixture 4μl，10μM目的基因上臂序列上游引物和目的基因下臂序列下游引物各1μl，模板1μl，模板为第一步反应PCR产物，2.5U/μlDNA Polymerase0.5μl，ddH₂O 7.5ul；PCR扩增条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸7min共39个循环72℃延伸10min；

步骤3)中的自然转化具体为：

3.1)将保存于-80℃的拟态弧菌SCCF01株复苏于LB培养基或者接种于TCBS琼脂培养基，含30℃培养24h，挑取单菌落接种于10ml LB液体培养基，在30℃条件下180r/min振荡培养至OD600为0.4，将5ml菌液8000×g离心5min，弃上清后使用1ml灭菌无葡萄糖M9培养液洗涤一次后，再用1ml无葡萄糖M9培养液重悬，其中，无葡萄糖M9培养液中加入32mM MgSO₄和5mM CaCl₂；

3.2)向重悬菌加入80mg高温灭菌后的几丁质，30℃孵育24h；

3.3)轻轻吸去孵育后的上清，重新加入1ml无葡萄糖M9培养液重悬和DNA总量大于500ng的重组片段PCR产物，30℃孵育24h，其中，无葡萄糖M9培养液中加入32mM MgSO₄和5mMCaCl₂；

3.4)将孵育后的细菌涡旋振荡20s，吸取100μl菌液涂于LB+Kan平板上筛选缺失株。

2.权利要求1所述的基于自然转化的拟态弧菌遗传重组方法在构建拟态弧菌缺失株中应用。