[发明专利]一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法及应用，该方法以拟态弧菌SCCF01株基因组为模板，使用目的基因上臂和目的基因下臂引物对扩增目的基因上臂序列和下臂序列；并扩增卡那霉素抗性基因片段；将扩增得到的卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段进行融合，得到含有卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段的融合PCR产物；将获得融合PCR产物与受体拟态弧菌SCCF01株进行自然转化，经过对抗性标记基因的筛选，获得拟态弧菌SCCF01株的缺失株。本发明操作过程相较于自杀质粒介导的基因重组技术和λ‑RED重组技术，无需电转质粒或打靶DNA，操作简单。

技术领域

本发明属于细菌遗传改造技术领域，具体地说，涉及一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法及应用。

背景技术

自然转化(Natural transformation)技术构建基因缺失株，是于2010成功应用于霍乱弧菌的基因编辑，并随后不断的予以完善。该方法的理论基础是基于细菌的自然转化(Natural transformation)原理，弧菌营养饥饿条件下通过几丁质诱导可成为自然感受态摄取外源DNA，当外源DNA与自身靶基因同源时可与细菌靶基因发生同源重组交换。但该技术还未在拟态弧菌上应用成功。基因缺失的方法还包括：自杀质粒介导的基因重组技术和λ-RED重组技术。自杀质粒介导的基因重组技术如下：1、通过含有抗性基因和靶基因同源的自杀质粒；2、通过结合转移或电转化的方式将构建的质粒转化进入打靶菌株，自杀质粒的同源部分会与细菌靶基因发生同源重组交换；3、通过抗生素平板对阳性缺失株进行筛选。该技术实验过程繁琐，重组效率低下。

λ-RED重组技术如下：1、电转化将PKD46质粒转化进入目的菌株，加入L-阿拉伯糖培养(PKD46质粒可通过L-阿拉伯糖诱导表达Exo、Beta和Gam蛋白，Gam蛋白可抑制核酸酶降解打靶DNA，Exo和Beta蛋白介导打靶DNA发生同源重组)；2、电击转化打靶DNA；3、通过抗生素平板对阳性缺失株进行筛选；λ-RED重组技术基于大肠杆菌λ噬菌体开发的基因敲除技术，较为广泛的应用于大肠杆菌或与大肠杆菌亲缘性相近的物种；拟态弧菌由于与大肠杆菌亲缘性较远将导致敲除效率低下；且操作繁琐。

现已能通过λ-RED重组技术构建拟态弧菌的基因缺失，但是其缺点如下：第一、λ-RED重组技术基于大肠杆菌λ噬菌体开发的基因敲除技术，较为广泛的应用于大肠杆菌或与大肠杆菌亲缘性相近的物种；拟态弧菌由于与大肠杆菌亲缘性较远将导致敲除效率低下；第二、需通过两次电转将PKD46质粒和打靶DNA转化至目的菌株，操作过程繁琐。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于自然转化的拟态弧菌高效遗传重组方法，包括以下步骤：

1)以拟态弧菌SCCF01株基因组为模板，使用目的基因上臂和目的基因下臂引物对扩增目的基因上臂序列和下臂序列；以PKD4质粒为模板，使用Kan引物对扩增卡那霉素抗性基因片段；

2)将扩增得到的卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段进行融合，得到含有卡那霉素抗性基因片段、目的基因上臂序列和下臂序列片段的融合PCR产物；

3)将步骤2)获得融合PCR产物与受体拟态弧菌SCCF01株进行自然转化，经过对抗性标记基因的筛选，获得拟态弧菌SCCF01株的缺失株。

进一步地，步骤1)中的PCR扩增的反应体系均为：Buffer 10μl，dNTP Mixture 4μl，10μM特异性的引物对上、下游引物各1μl，模板1μl，2.5U/μl DNAPolymerase0.5μl，ddH₂O 32.5ul。