[发明专利]一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体，其特征在于，所述载体以pMD19T-Simple载体为基础，在pMD19T-Simple载体TA克隆位点插入含有鸡痘病毒的早晚期启动子LP2EP2启动下的FADV4 fiber2基因、P11启动子启动下的lacz基因，以及用于同源重组的鸡痘病毒的基因组复制非必须片段LTYB和RTYB，所述载体序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体的构建方法，其特征在于，所述方法具体包括步骤如下：

(1)构建含同源重组臂基因的质粒pMD-TYB：以鹌鹑化弱毒株鸡痘病毒疫苗所抽提的核酸作为模板，使用引物LTYB-F/R、RTYB-F/R分别扩增左右同源臂序列，先将扩增的左同源臂序列在TA克隆位点插入pMD19T-Simple载体，得到质粒pMD-LTYB，再将扩增的右同源臂序列插入到NotI和EcoRI位点间，得到含有左右同源重组臂的质粒pMD-TYB；

(2)构建质粒pMD22：合成含鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2、P11启动子的多克隆位点序列，并通过TA克隆位点插入pMD19T-Simple载体中，形成质粒pMD22；

(3)构建质粒pMD22-lacz：以质粒pSV-β-Galactosidase Control Vector为模板，使用引物lacz-F/R扩增lacz序列，并将扩增的lacz序列插入(2)中所得质粒pMD22的XhoI位点，形成质粒pMD22-lacz；

(4)构建中间载体pMD22-TYB-lacz：将(3)中所得质粒pMD22-lacz、(1)中所得质粒pMD-TYB用NotI酶切连接，形成含有左右同源臂、鸡痘病毒早晚期启动子LP2EP2的多克隆位点、P11启动下lacz基因的中间转移载体pMD22-TYB-lacz；

(5)扩增FADV4 fiber2基因：使用引物F4-fiber2-F/R；以鸡4型腺病毒的毒株为模板扩增FADV4 fiber2基因；

(6)构建重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-F4：将(5)中所得的FADV4 fiber2基因插入到(4)中所得质粒pMD22-TYB-lacz的SmaI位点，即得表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体pMD22-TYB-lacz-F4；

(7)将(6)中所得转移载体pMD22-TYB-lacz-F4与鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞，用X-gal进行蓝白斑筛选，挑取蓝斑鉴定阳性，继续传代直至所有斑都为蓝斑为止；

(8)鉴定重组鸡痘病毒的表达效果。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中FADV4 fiber2基因通过用infusion酶无缝连接方法插入到质粒pMD22-TYB-lacz的SmaI位点。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(7)中鸡胚成纤维细胞通过如下方法制备：

①将选好的两枚9-10日龄的发育良好的SPF胚用5％的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘；②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头、四肢和内脏；③再用PH7.2的PBS冲洗两次；④用手术剪剪成2-3mm小块，用PH7.2的PBS冲洗两次；⑤加20ml 0.25％胰酶溶液，37℃消化15min，期间5min轻摇一次；⑥消化结束，将细胞消化倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中过滤；⑦将过滤液2000rpm离心5min，弃去上清液，将细胞用含10％FCS的DMEM培养基溶解；⑧用六孔板每个孔接种2ml，37℃，5％CO2培养箱培养16h左右。

5.根据权利要求1所述的重组鸡痘病毒转移载体在制备FPV载体疫苗中的应用。

6.根据权利要求2所述的构建方法所得的重组鸡痘病毒转移载体在制备FPV载体疫苗中的应用。

7.一种抗鸡4型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体疫苗的制备方法，其特征在于，制备方法如下：

(1)将权利要求1所述的载体或权利要求2-4任意一项所述的方法所制得的表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体与鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞，挑取鉴定为阳性的蓝斑继续接种于铺满单层的鸡胚成纤维细胞上，于37℃，5％CO2培养箱孵育2h后继续进行蓝白斑筛选纯化，如此反复进行多代次的纯化，直至所有病变出现的空斑均为蓝斑，则纯化完成；

(2)将纯化好的病毒液再接种于鸡胚成纤维细胞上进行传代，收集病毒液，将该病毒液生产成抗鸡4型腺病毒的重组鸡痘病毒转移载体疫苗。