[发明专利]一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，主要涉及一种表达鸡4型腺病毒(FADV4)fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用。所述载体以pMD19T‑Simple载体为基础，TA克隆位点插入FADV4fiber2基因、lacz基因，以及用于同源重组的鸡痘病毒的基因组复制非必须片段LTYB和RTYB。所述方法包括步骤如下：质粒pMD‑TYB；构建质粒pMD22；构建质粒pMD22‑lacz；构建中间载体pMD22‑TYB‑lacz；扩增FADV4 fiber2基因；构建重组鸡痘病毒转移载体pMD22‑TYB‑lacz‑F4；将转移载体pMD22‑TYB‑lacz‑F4与鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞，鉴定选出阳性，继续传代培养；鉴定重组鸡痘病毒的表达效果。本发明构建的重组鸡痘病毒转移载体为研制高效的表达鸡4型腺病毒的重组鸡痘病毒基因工程活载体疫苗奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及一种表达鸡4型腺病毒(FADV4)fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是一种无囊膜的双链DNA病毒，衣壳呈规则的20面体结构，直径约80～110nm，属于腺病毒科禽腺病毒属，根据其群特异性抗原的不同禽腺病毒可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共3群。Ⅰ群禽腺病毒主要从鸡、火鸡、鹅及其它禽类获得，分为5个种(A～E)，每个种内的病毒主要根据交叉中和试验结果进一步分为12个血清型(FAdV1～12)。禽腺病毒C包括禽腺病毒4型和10型(FAdV-4、FAdV-10)，其主要临床和病理症候群为心包积水综合征、包涵体肝炎等。

禽腺病毒衣壳主要由六邻体(hexon)和五邻体(penton)构成，而五邻体结合着两根纤维突起，为纤维蛋白(fiber)，两根纤维蛋白分别为fiber1和fiber2，纤维蛋白可与细胞表面的病毒受体结合，在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用，其中fiber2基因能够增加鸡群的抗体水平，在遭受禽腺病毒的攻击时提供更好的保护作用。(AnnaSchachner,Ana Marek,Barbara Jaskulska,Ivana Bilic,Michael Hess，RecombinantFAdV-4 fiber-2 protein protects chickens against hepatitis–hydropericardiumsyndrome(HHS).Vaccine 32，2014:1086-1092)

2015年6月份以来，我国江苏、安徽、河南、山东、辽宁、内蒙等地的鸡群陆续发生了不明原因的以心包积液、肝脏肿大为特征的疾病。根据病变，该病被称为“鸡心包积液-肝炎综合征”。通过病原分离鉴定和动物回归试验，许多专家学者们以不同的方式，最终确定该病的病原为禽腺病毒4型(fowl adenovirus 4，FAdV-4)(孙跃勇中兽医理论解析安卡拉1008-4754.2015.12.014)。该病于1987年最早发现于巴基斯坦卡拉奇市附件的安卡拉地区，故也称为安卡拉病，我国之前尚未见该病发生与流行的报道。

该病主要发生于20～30日龄的肉鸡，包括817、肉杂等，自然发病日龄最小的为7日龄。发病后4～8天为死亡高峰，病程为8～15天，死亡率达20％～30％。发病日龄越小，死亡率越高。鸡死亡前均正常采食，无明显临床表现而突然倒地死亡(常维山，王涛鸡心包积液综合征(安卡拉病)病原分离检测疾病防治1008-4754.2015.12.013)。同时20～70日龄以及200～300日龄的蛋鸡也有发生，但死亡率低于肉鸡。

目前，该病仍有发生与流行，给我国养鸡业造成了一定的经济损失，因而对该疾病的防控显得尤为关键。在疫苗方面，目前有疫苗厂家生产了相应的鸡胚灭活疫苗、细胞培养的灭活疫苗，但效果不是很理想，灭活疫苗只能一定程度上阻止该病的发生，在免疫预防中使用时所存在的一些不足，如抗体产生慢，无法区分疫苗免疫和野毒感染而无法进行疫情监测，免疫效果差，需要多次免疫，增加了成本等，因此需要开发更加有效的疫苗来对鸡4型腺病毒进行防控。

足见，现有技术还有待完善。

发明内容