[发明专利]一种锁核酸修饰的LAMP引物组合物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及核酸扩增技术领域，具体涉及一种锁核酸修饰的LAMP引物组合物及其应用。

背景技术

随着检验医学的发展，一些分子生物学技术，如PCR、链置换扩增等，在医学检验与诊断方面发挥了重要的作用。然而，由于分子生物学技术检测核酸对仪器、设备的要求较高，操作程序复杂，限制了其作为快速诊断方法的开展与推广,环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification，LAMP)，解决了核酸诊断中设备昂贵、程序复杂等难题。

LAMP反应仅需一种具链置换活性的DNA聚合酶(如Bst、Gsp等)及针对靶基因6-8个区域设计的4-6条引物(F3/B3和FIP/BIP必需，LF/LB可选)便可在60℃～66℃的恒定温度下实现几十分钟内大于10⁹倍的靶基因扩增，其检测的低限可达10拷贝/微升，凭借极高的扩增效率及较低的仪器要求，该技术已逐渐应用于病原体识别、生物标志物检测、性别鉴定等，值得注意的是：LAMP技术在临床旁快速检测、野外检测及资源有限的基层实验室检测领域有广阔的前景。

然而，近年来LAMP技术在实验室中的实际应用相对局限，进展相对缓慢，发明人根据前期的研究发现，限制其广泛应用的重要原因有两个，具体为：(1)当前的LAMP体系难以实现真正意义上的高通量的检测，有待于进一步完善，；(2)虽然LAMP体系，检测过程中无需升降温，可以大大加快反应速度，实现高效、快速检测，然而LAMP体系的稳定性较差，且LAMP扩增中由于引物数目众多，加剧了引物来源的非特异扩增问题，包括引物内部的非特异性扩增(空白对照体系中出现假阳性)和引物与模板的非特异性结合扩增，虽然这方面的文献报道相对较少，但非特异性扩增的问题严重限制了该技术的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，针对LAMP的非特异性扩增问题，提出一种基于锁核酸引物的环介导等温扩增体系及其核酸扩增方法，其可显著提高LAMP扩增体系的稳定性和特异性，对于LAMP技术的进一步完善和临床应用的推广具有重要意义。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明提供一种锁核酸修饰的LAMP引物组合物，包括F3/B3引物和FIP/BIP引物和/或LF/LB引物，在该LAMP引物组合物中，锁核酸的修饰位置为引物的3’端。

锁核酸(locked nucleic acid,LNA)是一种特殊的双环状寡核苷酸衍生物，结构中含有1个或多个2，-O，4，-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2，-O，4，-C位通过不同的缩水作用形成氧亚基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3，-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力；3’端经LNA修饰的引物可以提高特异性PCR扩增过程中的错配识别能力，并且其无需像ARMS引物那样在3’端的第二个碱基或第三个碱基处额外引入错配，可在保证扩增效率的同时保证扩增的特异性。

进一步地，锁核酸修饰的引物为FIP引物和BIP引物。

进一步地，所述锁核酸的修饰位置为引物的3’端最外侧的3个碱基中的至少一个；优选引物的3’端最外侧3个碱基中的倒数第2-3个碱基中的至少一个，更优选引物的3’端最外侧3个碱基中的倒数第2个或倒数第3个碱基。也可采用3’端最外侧的任一合适的第n个碱基中的至少一个。

另一方面，本发明还提供一种含有上述LAMP引物组合物的环介导等温扩增体系。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

进一步地，所述环介导等温扩增体系包含甲酰胺。

进一步地，在所述环介导等温扩增体系中，所述甲酰胺的浓度为0.1vl％-10vl％。；更优选为0.5vl％-5vl％，更优选为0.5vl％-2vl％，更优选为0.5vl％-1.5vl％，更优选为1vl％。甲酰胺的浓度可根据具体的反应体系进行相应的调整，但其浓度也不应太高，例如在某些反应中甲酰胺浓度为15vl％左右时或者在另外一些反应中甲酰胺浓度为5vl％左右时就会会大幅降低扩增效率，导致检测灵敏度大大降低。

进一步地，所述环介导等温扩增体系含有热启动酶，其初始浓度为4-20U。优选地，所述热启动酶包括HotStarTaqDNA聚合酶、AntiTaqDNA聚合酶或其他任一合适的热启动酶。