[发明专利]一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及脑卒中的辅助诊断技术领域，特别涉及一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法，尤其指一种能用于检测与脑卒中相关的二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

脑卒中(cerebral stroke)是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。脑卒中具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点，临床表现为严重头痛、昏厥、失去意识等，这也成为了中国成年人残疾的首要原因。脑卒中患者需要长期服用降压药，定期进行常规检查，控制颅内压，可见脑卒中患者给社会和家庭带来了极大的经济负担。脑卒中是一种由遗传和环境因素共同作用引起的复杂性疾病，对脑卒中发病机制的探索进而寻找出适合诊断治疗药物已然成为了现今研究的一个热点。而在脑卒中的发病机制尚未清晰阐明的情况下，对脑卒中的预防以及早期检测更是刻不容缓。

二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)是一种蛋白编码基因，它能够催化二氢叶酸转化为四氢叶酸。该蛋白的缺乏会导致同型半胱氨酸水平升高，进而提高脑卒中的患病风险。二氢叶酸还原酶是由位于第5号染色体的二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolate reductase gene，DHFR)(Chr5: 79950220—79950350)编码而成的。现在国内外的研究已经确定同型半胱氨酸水平与脑卒中的发生有着较大的关联，但是对同型半胱氨酸水平的影响因素与其调控机制的研究较少。

目前，国内外还没有公开任何关于用于检测与脑卒中相关的二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测方便、针对性强、检测准确率高的一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒；通过对样品DNA甲基化水平测定辅助诊断脑卒中，检测方法简单、检测效率高。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒，所述的检测试剂盒包含一对二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物，所述的一对二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物：

所述的甲基化特异性上游引物包括以下核苷酸序列：

5’- TATTTGAGCGGTGGTTAG -3’；

所述的甲基化特异性下游引物包括以下核苷酸序列：

5’- TCTACTATAACGAACGAACTC -3’。

一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒的检测方法：其特征是：包括以下步骤：

步骤一、提取样本的全血基因组DNA，并检测所得DNA的浓度；

步骤二、采用甲基化试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；

步骤三、荧光定量实时特异性PCR前期准备：在引物含量为10uM 条件下， 分别加入 Primer TE 或 dd H2O 进行稀释；

步骤四、进行荧光定量实时特异性PCR：取步骤二中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶，并加入一对二氢叶酸还原酶启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增；

步骤五、对结果进行甲基化程度分析。

为优化上述技术方案，采取的具体措施还包括：

上述的步骤一中采用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度。

上述的步骤二中采用EZ DNA Methylation-Gold 试剂盒对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。

上述的步骤四中PCR扩增条件为：首先95℃ 10min的预变性；接着95℃ 20s，Tm 20s，72℃ 30s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应40℃ 10min。

本发明一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法，所述的检测试剂盒包含一对二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物，所述的一对二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物包括甲基化特异性上游引物和甲基化特异性下游引物；通过检测与脑卒中相关的二氢叶酸还原酶基因启动子区甲基化程度辅助诊断脑卒中，简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于脑卒中的早期发现和及时治疗。

其具有以下优点：

1）高效、准确