[发明专利]枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因及其用途

权利要求书

1.一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，其特征在于：该尿酸氧化酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述尿酸氧化酶基因全长1485bp，编码494个氨基酸，申请GenBank序列号为KX388349。

2.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，其特征在于：该基因能够在体外稳定表达，并产生高活性的尿酸氧化酶。

3.如权利要求2所述的一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，其特征在于：所述该基因通过体外重组获得重组蛋白的方法包括如下步骤：

(1)枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因的克隆：以枯草芽孢杆菌BS04基因组DNA为模板，Uri-F和Uri-R为引物，进行PCR扩增，扩增产物回收和纯化，再与pEASY-T1载体连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒测序，获得枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因；

所述的Uri-F为5’-ATGTTCACAATGGATGACCTG-3’；

所述的Uri-R为5’-GGCTTTCAGGCTC-3’；

(2)枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因原核表达载体的构建：以枯草芽孢杆菌BS04基因组DNA为模板，Uri-P-F和Uri-P-R为引物，进行PCR扩增，将PCR产物和PET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接，转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体PET-Uri；

所述Uri-P-F为5’-CCCGAATTCATGTTCACAATGGATGACCTG-3’；

所述Uri-P-R为5’-TTGCGGCCGCGGCTTTCAGGCTC-3’；

(3)重组蛋白的诱导表达、纯化：将步骤(2)得到的PET-Uri转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养，挑取阳性转化子于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养至OD值为0.6-0.8时加入IPTG进行诱导，使其终浓度为0.1mmol/L，培养4h；

将阳性重组菌以1％的接种量添加到含有氨苄青霉素的培养基中，大量培养，诱导表达，离心，收集菌体超声波破碎，再离心收集上清，上样、结合、洗脱，获得纯化的重组蛋白。

(4)重组蛋白的活力测定：将步骤(3)获得的重组蛋白，参照Koyama等的方法，测定其酶比活力约为36.65U/mg。

4.如权利要求1所述的一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌BS04，已于2014年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M 2014294。