[发明专利]枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因及其用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，从枯草芽孢杆菌BS04中克隆到尿酸氧化酶基因，该基因能够在体外稳定表达，并产生活性较高的尿酸氧化酶。

背景技术

尿酸酶又称尿酸氧化酶(Uricase or Urate oxidase)，是动物嘌呤代谢过程中的一种重要的酶，是以分子氧作为受体，在嘌呤代谢中有重要的作用，能催化尿酸氧化，生成尿囊素、CO₂和H₂O₂。尿酸氧化酶在生物界中广泛存在，除人类和一些高等灵长目动物外，绝大多数生物体内(包括古细菌、细菌、真菌、放线菌、植物、鱼类和大多数非灵长目哺乳动物)都能产生具有生物活性的尿酸氧化酶。而人类在进化的过程中因尿酸氧化酶基因发生无义突变，不能合成尿酸氧化酶进而失去分解尿酸的能力，使尿酸成为人类嘌呤代谢的最终产物，造成人的血尿酸水平较其它哺乳动物高。高浓度的尿酸是人类罹患高尿酸血症、痛风及其相关疾病的元凶。现今用于治疗痛风及相关疾病的药物主要是别嘌呤醇、秋水仙碱等化学药物，具有严重的副作用，这促使人们寻找更安全高效的降尿酸药物。

尿酸氧化酶由于降解尿酸的高效率而受到人们的关注，由最初从黄曲霉中提取尿酸氧化酶用于医疗，到现在采用基因工程技术来重组表达尿酸氧化酶，这使得尿酸氧化酶的研究发展迅速。由于从微生物中直接提取尿酸氧化酶周期长、易污染、产量低、纯度不高，而利用基因重组获得尿酸氧化酶则可以克服上述缺点。为此，有学者将黄曲霉的尿酸氧化酶基因重组到大肠杆菌中，也有学者将其重组到酿酒酵母中，出现了有酶活性、但表达量低、提纯难度大等问题。

近年来，关于尿酸氧化酶的相关研究均有报道，但在实际生产过程中酶活性低、热稳定性差，限制了其在治疗高尿酸血症及痛风相关疾病中的应用。枯草芽孢杆菌广泛存在于自然界中，生长周期短，繁殖速度快，从中分离鉴定尿酸氧化酶基因并表达，获得纯化蛋白，无疑为获取高表达高活性的尿酸氧化酶提供了新的途径，具有潜在的市场价值和应用前景。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种来自枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因及其用途，该基因能够在体外稳定表达，并产生活性较高的尿酸氧化酶。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究和不懈探索，最终获得了如下技术方案：

一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，该尿酸氧化酶基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述尿酸氧化酶基因全长1485bp，编码494个氨基酸，申请GenBank序列号为KX388349。

优选地，如上所述的一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，该基因能够在体外稳定表达，产生的尿酸氧化酶酶比活力约为36.65U/mg。

优选地，如上所述的所述的一种枯草芽孢杆菌的尿酸氧化酶基因，所述该基因通过体外重组获得重组蛋白的方法包括如下步骤：

(1)枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因的克隆：采用CTAB法提取枯草芽孢杆菌BS04的基因组DNA，根据GenBank数据库中已报道的尿酸氧化酶基因的序列，设计1对特异引物Uri-F和Uri-R，以基因组DNA为模板，Uri-F和Uri-R为引物，进行PCR扩增获得枯草芽孢杆菌BS04的尿酸氧化酶基因，所述的Uri-F为5’-ATGTTCACAATGGATGACCTG-3’；所述的Uri-R为5’-GGCTTTCAGGCTC-3’。

PCR扩增产物用胶回收试剂盒(Tiangen gel extraction kit)进行PCR产物的回收和纯化，再与pEASY-T1载体(Takara)连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒测序。测序结果表明，枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因的核苷酸序列见SEQ ID NO:1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。该尿酸氧化酶基因全长1485bp，编码494个氨基酸，并申请GenBank序列号为KX388349。

(2)枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶基因原核表达载体的构建：根据枯草芽孢杆菌BS04尿酸氧化酶的基因序列和原核表达载体PET-28a(+)的多克隆位点，设计1对特异性引物Uri-P-F和Uri-P-R，分别在上、下游引物添加了EcoRⅠ和NotI酶切位点，以枯草芽孢杆菌BS04基因组DNA为模板，Uri-P-F和Uri-P-R为引物，进行PCR扩增，将PCR产物和PET-28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体PET-Uri；