[发明专利]一种海水微藻常温液态保存配方和制作方法

说明书

技术领域

本发明涉及水产养殖育苗及养成中藻类的繁殖的海水微藻常温液态保存领域，通过调节海水微藻pH，并添加适当均质剂、NaCl、MgCl₂等成分来延长液态海水微藻的常温保存时间。

背景技术

微藻是指一些微观的单细胞、群体或丝状的藻类，大多数是浮游藻类，生物量大、分布广，藻类通过热解可获得生物质燃油，是重要的可再生生物能源；通过农业化学技术可从一些富含脂肪的微藻中提取油脂，用于制备食用油或生物柴油；藻类中还含有多种维生素、胡萝卜素、蛋白质、脂肪酸等成分，是药用活性物质的重要来源；藻类还可用于污水处理等，藻类生物与人类的生存和发展有极其密切的关系，是重要的可再生生物资源。

微藻藻种的保藏技术一直是制约生产、藻种正常供应和长期保存的重要因素。在科研与生产中，微藻藻种可实现短期保藏，但存在着保藏时间短、易染杂菌、不便于运输、复活过程繁琐等的缺陷。而长期保存微藻需要降低温度，但是过低的温度又会造成藻种的死亡，而且用固体培养基长期保藏会造成固体培养基表面干燥，所以也需要定期移种，造成污染和杂菌生长，不利于运输。目前常用液体传代保藏法保藏藻种，这种方法保种时间短，在低温下仅能保藏3个月，营养盐消耗也快，易污染，工作量也大，容易造成保种的失败。因此需要开发出理想的易于复活使用的中长期藻种保存方法。

发明内容

为了适应生产需求，针对现有技术的不足，本发明提供一种适应生产需要的的中长期保存微藻藻种的方法，本发明方法具有能够避免杂菌污染、保存效果好、时间长、并且在常温下能够保存、便于运输以及可方便复活使用等诸多优点。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：

本发明方法中，所保存的微藻藻种可以选自普通小球藻、葡萄藻、小环藻、微绿球藻、硅藻等单细胞藻类之任何一种，本发明方法中，所收集的藻种培养液生长状态良好，最优选藻液处于生长的稳定期，本发明方法中该配方包含以下成分：

1）细胞数量≥10²⁰CFU/ml的藻类浓缩液50-80%；

2）藻类营养液10-30%；

3）均质剂：0.1-0.25%。

海水微藻用柠檬酸或乳酸调节pH=4.5-4.8,并添加NaCl（1.5g/L）和MgCl₂（0.075g/L）。

所用均质剂是琼脂粉、右旋糖苷、海藻酸钠混合物，比例为：12:5:1。

藻类营养液成分：

NH₄NO₃=50-100mg ； K₂HPO₄ =5mg；FeC₆H₅O₇=0.1-0.5mg；海水=1000ml。

本发明技术方案通过扩增培养，在无菌条件下培养到指定细胞浓度，无菌灌装，避免有害细菌等滋生污染产品。

本发明可以通过以下具体步骤得到进一步实现：

（1）藻类的培养：将纯培养的藻种进行一级、二级扩种培养

藻种的一级培养：在超净工作台下，将保种的纯培养的藻种接种到1L三角瓶中（装有600ml藻类生长培养基），置于光照培养箱内，调节温度25℃，光照强度5000Lx，每天摇瓶6次，当藻种浓度超过10⁶CFU/ml时得到一级藻类培养液。

藻类二级培养：在无菌操作下，将一级培养藻种按照1:3比例接种到10L广口瓶中，调节温度25℃，光照强度5000Lx，每天摇瓶6次，当藻种浓度超过10⁶CFU/ml时得到二级藻类培养液。

大量培养：无菌接种到100L的塑料桶中，调节温度25℃，光照强度5000Lx，进行充气培养，期间可补充培养液，使藻种浓度达到10⁶CFU/ml。

（2）将处于稳定生长期的藻液通过镜检，确定无杂菌后离心收集藻泥。

（3）将步骤(2)的藻泥加入配制藻类营养液，制成藻种细胞悬液，藻细胞密度大约≥10²⁰CFU/ml。

（4）配制均质剂：将琼脂粉、右旋糖苷、海藻酸钠按照12:5:1的比例混合，溶于藻类营养液中，加热煮沸5min，冷却备用。

（5） 向（3）中加入0.1-0.25%的均质剂，海水微藻用柠檬酸或乳酸调节pH=4.5-4.8,并添加NaCl（1.5g/L）和MgCl₂（0.075g/L）。