[发明专利]一种干酪乳杆菌来源的D‑乳酸脱氢酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种干酪乳杆菌来源的D-乳酸脱氢酶及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

手性α-羟基酸是合成许多药物、化学材料的重要前体物质。例如，苯乳酸(Phenyllactic acid,PLA)又名2-羟基-3苯基丙酸，存在两种对映异构体，D-PLA和L-PLA。D/L-PLA均具有广谱且高效的抑菌活性，是一种新型天然生物防腐剂，可作为饲料添加剂替代畜禽饲料的抗菌剂。

D-乳酸脱氢酶(D-Lactate dehydrogenase，D-LDH，EC 1.1.1.28)，是脱氢酶中十分重要且研究较多的一种酶，也是生物体内糖酵解途径中一种关键的氧化还原酶。已有研究发现多种D-LDH可不对称还原苯丙酮酸(phenylpyruvic acid,PPA)生成D-PLA，如来源于Pediococcus acidilactici和Pediococcus pentosaceus的PaLDH和PpLDH，Lactobacillus plantarumWCFS1中的D-LDH及Lactobacillus bulgaricus ATCC 11842中的D-nLDH等。但是不同的D-LDH不对称还原PPA的能力存在明显差异，胡发根等利用来源于Lactobacillus plantarum的重组LDH将55mM PPA在1h内转化生成了30.5mM D-PLA，摩尔转化率为54.5％，光学纯度达到100％。而来源于Lactobacillus bulgaricus的D-nLDH突变体偶联甲酸脱氢酶后可将50mM PPA在90min内完全转化，其D-PLA产率为99.0％，ee_p>99.9％。因此，为获得高纯度，高产量的D-PLA，利用分子生物学手段不断挖掘出性状优良的D-LDH，具有重要的工业化应用价值。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种来源于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的D-乳酸脱氢酶，命名为LcLDHD，其氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有苯丙酮酸还原活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供编码所述D-乳酸脱氢酶的基因LcldhD。

在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO.1所示基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-28a(+)为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21、E.coli JM109、E.coli DH5α、或E.coli TOP10。

本发明的第四个目的是提供构建所述基因工程菌的方法，是将SEQ ID NO.1所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌细胞中。

在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET-28a(+)。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21(DE3)。

本发明的第五个目的是提供生产所述乳酸脱氢酶的方法，是将所述基因工程菌接种至LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入终浓度为0.4～0.5mmol/L的IPTG诱导6～10h。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导是在24～28℃进行诱导。

本发明的第六个目的是提供所述D-乳酸脱氢酶的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是以苯丙酮酸为底物，加入所述D-乳酸脱氢酶，转化生产D-苯乳酸。

在本发明的一种实施实施方式中，所述应用是向每1mmol苯丙酮酸中加入2～8mg含的该D-乳酸脱氢酶的重组菌的湿菌体，于30～37℃，200～220rpm条件下反应20～60min。

有益效果：本发明构建的重组菌株E.coli BL21(DE3)pET-28a(+)-LcldhD可将10mmol/L苯丙酮酸在40min内完全不对称还原生成9.91mmol/L PLA，产率为99.1％，对映体过量值(ee_p)为98.3％，相比于现有技术，在反应时间缩短一倍以上的同时，转化率提高，取得了预料不到的技术效果。

附图说明