[发明专利]一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸及制备方法

说明书

技术领域

本发明公开一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸，同时提供了其及制备方法，用于猫弓形虫感染的血清检测，属于免疫学技术领域。

背景技术

弓形虫病是由刚地弓形虫引起的一种重要的人畜共患寄生虫病，该病寄生宿主广泛，可感染所有温血动物及部分变温动物和冷血动物。猫是该病的终末宿主同时也是中间宿主。感染弓形虫的猫，通过排出带有感染性卵囊的粪便来感染人类及动物等其他中间宿主。OIE将弓形虫病列为B类人畜共患传染病。IHA和IFA为国标中规定的检测方法。可是“国标”方法有着操作复杂、需要专业人员、耗时、检测条件要求高等诸多缺点，不适合实践中广泛推广。实验室常用的检测方法为酶联免疫吸附试验（ELISA），该方法适用于具有相关条件的实验室进行操作。试验中需要有专门的试验人员，相关的仪器设备，检测时间较长等原因，所以不合适用于基层现场操作使用。

免疫胶体金技术是近些年发展较快的一种快速检测技术。本发明通过胶体金技术来建立一种检测猫弓形虫病的免疫胶体金试纸，并进行了实际样品检测，为猫弓形虫检测及实验猫的标准制定及标准化奠定基础，同时为猫弓形虫病的防治提供技术支持和理论依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸，具有速度快、操作简单、不需特殊仪器等特点，适合临床中的现场检测及大规模的流行病学调查。

本发明还公开了一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸的制备方法，利用胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA），弓形虫表面抗原SAG3包被检测线（T线），兔抗SPA抗体包被质控线(C线)，以此为基础研制出本发明的检测猫弓形虫感染的免疫胶体金层析试纸条。

本发明涉及的一种检测猫弓形虫感染的胶体金免疫层析试纸条，包括玻璃纤维、硝酸纤维素膜（NC）、PVC底板、吸水板；其特征在于：

金标垫上的金标抗体为金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA），硝酸纤维素膜上的检测线（T）包被弓形虫表面抗原SAG3、质控线（C）包被兔抗SPA抗体，建立了一种胶体金试纸条检测方法。

本发明涉及的一种检测猫弓形虫感染免疫胶体金层析试纸条的制备方法，是通过表达纯化SAG3重组蛋白，利用柠檬酸三钠还原法烧制胶体金溶液，之后利用胶体金溶液对SPA进行标记，制备金标垫，组装试纸条。弓形虫表面抗原SAG3为检测线（T）、兔抗SPA抗体作为质控线（C），主要包括：

1、重组蛋白SAG3诱导表达

（a）取3μL原核表达的SAG3菌液，5μL卡那霉素置于5mL的 LB培养基中，转入37℃恒温振荡培养箱中，150r/min，振荡过夜；

（b）取振荡过夜的菌液转移至300mL的LB培养基中，同时加入300μL的卡那霉素，封口后转入37℃恒温震荡培养箱中进行恒温振荡培养，1.5h~2h；

（c）加入300μL的IPTG进行诱导，4~5h后4℃离心机7000r×7min，收集菌液；

（d）取PBS对步骤c）收集的菌液进行重悬，超声破碎，离心弃上清；

（e）用2mol/L尿素对沉淀进行充分吹打溶解后离心，弃上清；反复进行5次；

（f）用8mol/L尿素对洗后的沉淀进行溶解；

（g）离心后，取上清即得；

2、SAG3重组蛋白的纯化

（a）将透析袋放入去离子水浸泡5min激活；

（b）取重组蛋白放入激活的透析袋中密封；

（c）将透析袋加入6mol/L尿素溶液中，4℃条件下进行搅拌透析5h；

（d）按第（3）步分别通过4mol/L、2mol/L、1mol/L、0.5mol/L尿素进行梯度透析，用PBS将尿素置换；

（e）将步骤4）产物4℃、12000 r/min条件下离心5min，取上清-20℃保存；

（f）SDS-PAGE电泳；

3、胶体金试纸条的制备

取21mm的NC膜贴于PVC底板上；金标垫压在NC膜上，样品垫压在金标垫上，吸水纸压在NC膜上粘在底板上；取试纸条进行抗体的包被划线，检测线（T）划纯化的SAG3蛋白、质控线（C）划兔抗SPA抗体。

本发明的积极效果在于：