[发明专利]人hsa‑miR‑124a‑3pPCR检测方法及其在DS妊娠风险预测中的应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种人hsa-miR-124a-3p PCR检测方法及其在DS妊娠风险预测中的应用。

背景技术

唐氏综合征(Down's syndrome，DS)是人类最常见的一种导致新生儿智力缺陷和发育障碍的遗传性疾病，也称为21-三体综合征(trisomy 21，T21)或者先天愚型，其在出生胎儿中的发病率大约为1/700，而我国DS的发生率约为(1.53-2.40)/万。大多数DS胎儿在宫内即停止发育或引发流产，因此，DS实际发病率应远高于1/700。并且随着妇女妊娠年龄的增大，尤其是我国现阶段人口生育政策的变化，大龄或高龄孕妇增多以及辅助生育技术的进一步推广和应用，DS发病率有继续升高的趋势。DS患儿除了智力缺陷外，还常伴有先天性心脏病、甲状腺疾病、精神和体格发育迟滞以及器官和组织的多发性畸形等疾病。目前，做好DS患儿的产前早期筛查，避免其出生是最有效的预防DS方案。

DS的产前检查方案主要分为无创产前检查(noninvasive prenatal testing， NIPT)和有创产前检查，其中NIPT主要包括唐氏筛查和无创DNA检测，有创性检查主要包括羊膜腔液体穿刺检查、绒毛膜穿刺检查和胎儿脐带血检查。唐氏筛查是目前应用最广的DS产前筛查手段，主要结合了超声检查和孕妇血清标志物检验。唐氏筛查安全性高，但是特异性较差，虽然胎儿颈项透明层(nuchal translucency，NT)>2.5mm时，DS患病率高达84％，但是仍不能达到确诊的要求，唐氏筛查高危的孕妇仍然需要后续检查确诊。无创DNA检测是近年来兴起的DS产前检测手段，又称为无创产前DNA检查或者无创胎儿染色体非整倍体检查，主要依靠检测母体血液中胎儿游离DNA(cell free fetal DNA，cffDNA)，并对其进行序列分析以获得胎儿的遗传信息，从而诊断DS、帕陶氏综合征(Patau Syndrome，PS)和爱德华综合征(Edwards Syndrome，ES)，其安全性和灵敏度均较高，但是检查费用较高，技术操作复杂，检查周期较长，目前卫生主管部门对其实行资质认证管理，多在第三方的医疗检测机构应用，不易在临床特别是基层医疗机构推广。羊膜腔液体穿刺检查、绒毛膜穿刺检查和胎儿脐带血检查均通过侵袭性操作获得胎儿脱落细胞并对其进行染色体核型分析，达到确诊的目的，虽特异性较高，但是侵袭性操作对操作者的临床经验要求高，且有 1％导致流产的机率。目前，染色体核型分析虽然是产前诊断DS的金标准，但是其检测技术复杂、条件要求高且检测周期长，故仅局限于唐氏筛查的高危孕妇。因此，建立一种安全、价格合理又特异的DS产前检测手段仍旧是产前诊断领域探索的方向，而与cffDNA同属于血液常见分子的微小RNA(microRNAs， miRNA)分子开始引起人们的重视。

miRNA是一类长度约为20-25个碱基的非编码RNA小分子，其主要生理作用是调控基因的表达。miRNA可以耐受血液中RNA酶的降解，可以在循环血液中长期稳定的存在，同时miRNA还可以耐受外界强酸、强碱的处理，为miRNA 的检测带来了方便。此外，miRNA还具有很强的组织和器官的特异性，为其成为理想的疾病循环血液学标志物奠定了坚实的基础。目前研究显示，健康胎儿和唐氏患儿孕中期母体血浆存在135种表达差异的miRNA分子，其中， hsa-miR-124a-3p是表达量显著性升高的miRNA分子中差异值最大的分子。

发明内容

针对以上问题，本发明提供一种操作简单、结果准确可靠的人 hsa-miR-124a-3p PCR检测方法及其在DS妊娠风险预测中的应用。

本发明实现其目的所采用的技术方案如下：

一种人hsa-miR-124a-3p PCR检测方法，包括如下步骤：

1)提取待测人血浆样品的总RNA；

2)对提取的RNA利用RT-qPCR进行检测：

A、RT反应：RT引物序列为：

5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACG GCATTC-3′，RT反应程序：16℃30min，42℃30min，85℃5min；

B、qPCR反应：qPCR反应程序为：50℃2min，95℃10min；95℃15s， 60℃60s，35个循环；

3)建立标准曲线，计算待测样品中的hsa-miR-124a-3p浓度。