[发明专利]钝顶螺旋藻活性蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，尤其是涉及钝顶螺旋藻活性蛋白的制备方法。

背景技术

螺旋藻(Spirulina platensis)是一类低等植物，属于蓝藻门(Cyanophyta)、颤藻科(Oscillatoriaceae)。它们与细菌一样，细胞内没有真正的细胞核，所以又称蓝细菌。螺旋藻通常为多细胞构成的丝状体、圆柱状，呈疏松或紧密而规则的螺旋状弯曲，但形状往往受生长环境的影响而发生改变，有的甚至产生稳定的直线形变异。螺旋藻性喜高温（25－36℃）、高碱（pH8~12），营光合自养，但也能利用环境中的一些有机物作兼养生长，行无性繁殖，通常依靠藻丝体中横隔的产生或藻丝体中伪空胞的产生而形成藻殖段。螺旋藻含有大量蛋白质、极其丰富均衡的营养成分和多种生物活性物质，其细胞壁几乎不含纤维素，因此极易被人体消化吸收，研究表明螺旋藻的消化吸收率在94%以上，其蛋白消化率达75%，是一种优良的纯天然食品，被联合国粮农组织推荐为“全球人类最理想的食品”。螺旋藻蛋白质含量高达50－70%，由18种氨基酸组成，其中人体与动物所必须的8种氨基酸的含量接近或超过了FAO推荐的标准，是自然界中具有重大开发价值的食用和饵料蛋白资源，具有一定的医疗保健作用。螺旋藻还含有七种维生素，其中维生素E是一种天然抗氧化剂，β－胡萝卜素是活性最高的维生素A源，维生素A是一种自由基清除剂，对肿瘤(尤其是上皮组织癌变)的防治有明显效果。螺旋藻多糖和藻胆蛋白更有着显著的生理活性和多方面的药用价值，如防治肿瘤和溃疡、提高机体免疫功能、调节血压、促进动物血细胞再生等。综上所述，螺旋藻及其活性成分在功能性食品研究与开发方面有着广阔的应用前景。

现有技术如授权公告号为CN 103044520 B的中国发明专利，公开了一种节旋藻蛋白的分离纯化方法，具体方法是将藻粉在PBS中充分浸泡，混匀后常温下避光放置24-72小时离心，收集上清液；将上清液经滤膜进行超滤浓缩，浓缩液中加入甲壳胺使混合液pH达到6.5-7.2，并进行搅拌；上述搅拌均匀的混合液离心取上清液，上清液中加入水经滤膜进行超滤浓缩，超滤置换钠离子得到纯化浓缩液；浓缩液喷雾干燥，即得药品级节旋藻蛋白。该方法生产成本低，简单有效，适合制备药品级节旋藻蛋白，但是制备效率低，节旋藻蛋白得率低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种活性蛋白提取效率高、得率高、纯度高、能耗低、对环境友好的钝顶螺旋藻活性蛋白的制备方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：钝顶螺旋藻活性蛋白的制备方法，包括粗蛋白的提取、盐析、透析、纯化，具体步骤为：

粗蛋白的提取：按料液比为1:2~3在藻粉中加入蒸馏水，抽滤，去离子水洗涤2~3次，加入pH为6.5~7、浓度为0.008~0.012mol/L的磷酸盐缓冲液和活性多肽，藻粉与磷酸盐缓冲液的重量体积比为1:14~16，搅拌110~130min，在-22~-20℃快速冷冻，然后在3~5℃下解冻，反复冻融3~4次，在3~5℃、10000~12000rpm下高速冷冻离心28~33min，上清液即为粗蛋白液，活性蛋白属于胞内蛋白质，首先要破碎细胞的细胞壁、细胞膜使其溶出，细胞破碎程度越高，活性蛋白的得率也越高，反复冻融法利用细胞内冰粒的形成和细胞液盐浓度增高引起溶胀使细胞破碎，操作简单，不需要特殊的仪器设备，该步骤采用蛋白肽和反复冻融法相结合，提高粗蛋白提取的工作效率和活性蛋白的得率；

盐析：向粗蛋白液中加入浓度为1.8~2.2wt%的壳聚糖溶液，藻粉与壳聚糖溶液的重量体积比为1:4~6，调节pH至6.5~7，搅拌20~25min，在3~5℃、10000~12000rpm下高速冷冻离心28~33min，将上清液放入冰水浴中，加入硫酸铵使其浓度为50~55wt%，搅拌至硫酸铵完全溶解，静置过夜后低温离心，即得盐析沉淀物，该步骤中加入大量的硫酸铵，使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出，该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性，盐析效果好，节约能耗；

透析：将盐析沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液，然后装入透析袋，排除气泡，封口，置于磷酸盐缓冲液中透析，更换缓冲液4~6次，袋内溶液即为透析液，该方法利用小分子物质在溶液中可通过透析袋，而大分子物质不能通过透析袋的性质，达到分离小分子杂质的目的，操作简单，效果好，节约能耗；