[发明专利]一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法

权利要求书

1.一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、DNA提取：采用粪便基因组提取试剂盒，将肉鸡盲肠内容物总DNA提取于1.5mLEP管中，测其核酸浓度，灭菌超纯水稀释到20ng/μL，与原液一起保存于-20℃冰箱，待用；

步骤2、合成肉鸡肠道微生物PCR引物；

步骤3、构建肉鸡肠道微生物质粒；

步骤4、制作标准品；

步骤5、进行样品检测。

2.根据权利要求1所述的肉鸡肠道微生物的定量检测方法，其特征在于，所述步骤3中构建肉鸡肠道微生物质粒具体为：

1)以肉鸡肠道内容物总DNA为模板，用步骤1中的引物进行PCR扩增，按照PCR反应体系扩增产物，琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶DNA小量回收试剂盒回收纯化目的片段，测OD值，-20℃保存；

2)用试剂盒将1)中纯化的目的片段连结在载体上并转化，按照说明书制备10μL连接混合液，16℃，30min；1μL混合液加入10μL DH5α冰上30min，做一个重复组；42℃热激90s，冰上3min；500μL的LB培养基，37℃，复苏45-60min，220RPM/min；4000RPM/min离心，2min，弃400μL，重悬，LA平板上涂板，37℃过夜培养，不超过16h；

3)挑取单菌落白斑，于10uL液体LA培养基中，取1uL进行菌落PCR，剩下的加500uL的液体LA培养基；PCR结果阳性的菌液测序；

4)测序结果在blast上比对，阳性结果菌液发酵后试剂盒提取质粒；

5)质粒测序，NCBI上blast比对结果，挑选与目的菌株匹配的质粒，检测DNA浓度，保存于-20℃冰箱，备用。

3.根据权利要求1所述的肉鸡肠道微生物的定量检测方法，其特征在于，所述步骤4中制备标准品具体为：将质粒按十倍稀释法，用灭菌超纯水稀释成10^-1-10^-9的浓度梯度，取9个无菌的1.5mLEP管，根据浓度由大到小依次编号1-9，并各加入90μL灭菌的超纯水，取肉鸡肠道微生物标准质粒原液10μL于试管中，快速轻柔吹打20-30次，重复该步骤至9号EP管，得到包括原液的10个梯度的标准品。

4.根据权利要求3所述的肉鸡肠道微生物的定量检测方法，其特征在于，所述步骤5中样品检测具体为：选取3-7号标准品与样品稀释液一起进行荧光定量PCR反应；试验所用设备为Bio-Rad 96孔荧光定量PCR仪。

5.根据权利要求2或4所述的肉鸡肠道微生物的定量检测方法，其特征在于，PCR反应的反应体系为上游引物和下游引物各0.8μL；RNase-Free ddH₂O 7.4μL；SYBR GREEN Supermix 10μL；DNA模板1μL。

6.根据权利要求4所述的肉鸡肠道微生物的定量检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的反应条件：预变性阶段，1次循环，温度95℃，预变性30s，不采集荧光信号；PCR反应阶段，40次循环，温度95℃，变性5s，退火温度50-60℃，时间30s，温度72℃，延伸20s，采集荧光信号；溶解曲线，72℃到95℃，每2s上升0.5℃。

7.根据权利要求1所述的肉鸡肠道微生物的定量检测方法，其特征在于，所述微生物为总菌、乳杆菌或大肠杆菌中的一种。