[发明专利]一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于于家禽肠道微生物检测技术领域，具体地说，涉及一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法。

背景技术

动物消化道存在着数目庞大、相对稳定的微生物群落。菌群的多样性能够保证肠道微生物区系平衡。微生物群落能够维持胃肠道环境相对稳定，促进营养物质消化吸收。家禽的大肠很短，食糜会很快进入盲肠，所以盲肠是微生物生存和活动的重要场所。

家禽肠道微生物分布，种类和数量的检测方法目前采用两种方法，一种是平板计数法，该法误差大，易污染，检测结果为活菌数，检测效果不好，并且耗时耗劳力。另一种是实时荧光定量PCR法，该方法灵敏度高，污染小，但依赖于标准品，检测菌种选择少，特异性不强。

绝对定量PCR(absolute quantification PCR，AQ-PCR)技术是利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线，通过测定未知样品的Ct值，从标准曲线上计算出该样品的起始浓度，实现了对测定样本基因的分子拷贝数的绝对定量。目前广泛应用的相对荧光定量PCR技术只是测定样本中的靶序列相对于参照样本量的变化，而不能测出初始模板起始拷贝数的绝对量。标准曲线的制备是绝对荧光定量PCR实验的关键步骤，目前家禽肠道微生物绝对定量PCR法多选择已知菌株为标准品，提取基因组制备标准曲线，测定样品时，标准品与未知样品同时进行PCR循环，根据未知样品的Ct值，结合标准曲线来求得未知样品cDNA的起始拷贝数。该方法会受到标准品的限制，检测菌种选择少，特异性不强，并且标准品菌株是利用平板计数法确定活菌数，存在较大误差。

发明内容

有鉴于此，本发明针对家禽肠道微生物检测方法目前存在误差大，耗时，检测效果不好，检测菌种限制，特异性不强的问题，提供了一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种肉鸡肠道微生物的定量检测方法，包括以下步骤：

步骤1、DNA提取：采用粪便基因组提取试剂盒，将肉鸡盲肠内容物总DNA提取于1.5mLEP管中，测其核酸浓度，灭菌超纯水稀释到20ng/μL，与原液一起保存于-20℃冰箱，待用；

步骤2、合成肉鸡肠道微生物PCR引物；

步骤3、构建肉鸡肠道微生物质粒；

步骤4、制作标准品；

步骤5、进行样品检测。

进一步地，所述步骤3中构建肉鸡肠道微生物质粒具体为：

1)以肉鸡肠道内容物总DNA为模板，用步骤1中的引物进行PCR扩增，按照PCR反应体系扩增产物，琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶DNA小量回收试剂盒回收纯化目的片段，测OD值，-20℃保存；

2)用试剂盒将1)中纯化的目的片段连结在载体上并转化，按照说明书制备10μL连接混合液，16℃，30min；1μL混合液加入10μL DH5α冰上30min，做一个重复组；42℃热激90s，冰上3min；500μL的LB培养基，37℃，复苏45-60min，220RPM/min；4000RPM/min离心，2min，弃400μL，重悬，LA平板上涂板，37℃过夜培养，不超过16h；

3)挑取单菌落白斑，于10uL液体LA培养基中，取1uL进行菌落PCR，剩下的加500uL的液体LA培养基；PCR结果阳性的菌液测序；

4)测序结果在blast上比对，阳性结果菌液发酵后试剂盒提取质粒；

5)质粒测序，NCBI上blast比对结果，挑选与目的菌株匹配的质粒，检测DNA浓度，保存于-20℃冰箱，备用。

进一步地，所述步骤4中制备标准品具体为：将质粒按十倍稀释法，用灭菌超纯水稀释成10^-1-10^-9的浓度梯度，取9个无菌的1.5mLEP管，根据浓度由大到小依次编号1-9，并各加入90μL灭菌的超纯水，取肉鸡肠道微生物标准质粒原液10μL于试管中，快速轻柔吹打20-30次，重复该步骤至9号EP管，得到包括原液的10个梯度的标准品。

进一步地，所述步骤5中样品检测具体为：选取3-7号标准品与样品稀释液一起进行荧光定量PCR反应；试验所用设备为Bio-Rad 96孔荧光定量PCR仪。

进一步地，PCR反应的反应体系为上游引物和下游引物各0.8μL；RNase-Free ddH₂O 7.4μL；SYBR GREEN Supermix 10μL；DNA模板1μL。