[发明专利]一种化学修饰UNG酶及其修饰方法和应用

说明书

本发明公开了一种化学修饰UNG酶，所述化学修饰UNG酶是由酸酐修饰的UNG酶。所述化学修饰UNG酶能在某一温度或以下不表现酶活性，而在特定温度下孵育一段时间后去修饰可以恢复正常活性，从而实现活性可控。本发明还提供一种用酸酐修饰UNG酶的方法、以及所述化学修饰UNG酶的应用。本发明的用酸酐修饰UNG酶的方法，可以制备的化学修饰UNG酶。所述化学修饰UNG酶用于EMA(多酶介导的核酸常温扩增)或其它核酸等温扩增方法中，可防止扩增产物污染反应体系和环境，耗时短，操作简单，活性可控。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种化学修饰UNG酶及其修饰方法、在核酸扩增中的应用。

背景技术

PCR是一种极灵敏的扩增技术，易受污染的影响，小量的外源DNA污染就可以与目的模板一起被扩增，从而影响扩增结果和判断。当前一次扩增产物由于误操作(主要是以气溶胶的形式)而进入新的扩增反应时，会发生共同来源的污染，这称之为残余污染；从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源。

由于扩增产物的量大且非常容易以气溶胶的形式扩散，即使实验室严格分区，也难免因为误操作而受到污染。为保证PCR结果的准确性，要预防非特异性PCR扩增和污染。常用的措施是使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)(也称为UDG，Uracil-DNA Glycocasylase，以下简称为UNG酶)和Taq酶热启动。

UNG酶是克隆有Uracil-N-Glycosylase基因的大肠杆菌经诱导表达后，再经三次过柱纯化分离出来的重组蛋白。UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dUMP的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。本发明所用的UNG酶是Thermus aquaticus在大肠杆菌中表达的，最佳活性温度为50-65℃，95℃下10分钟灭活。

UNG酶防污染技术原理是在扩增过程中以脱氧尿苷(dUTP)代替脱氧胸苷(dTTP)，或者以一定比例把dUTP加入到dNTP中，从而得到含有dUMP的扩增产物。尿苷酶(UNG)能特异地破坏含有dUMP的DNA产物，使之不能作为扩增模版，但对天然的不含dUMP的核酸不起作用。故只要在扩增反应前加入UNG酶，就可以破坏过往扩增反应残余的含有d-UMP的DNA，但对不含d-UMP的目标DNA不起作用，从而使目标DNA得到扩增。随后将UNG酶高温灭活，再进行扩增。这样就可以有效地防止实验室内扩增产物的残余污染，避免假阳性的出现。

现有技术将UNG酶运用于PCR扩增防污染，在PCR开始前增加30℃～37℃的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的dUMP的DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这一步骤的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增。这个处理对PCR有效，但是却无法用于等温或常温扩增。由于UNG酶在一定温度范围内(30℃-90℃)均有活性，在PCR扩增的时候，dUTP掺入扩增产物过程中，UNG酶会切除该碱基，影响最终扩增效率，因此在普通PCR开始之前，必须有一步热处理使UNG变性而失活。变性的温度要求较高(95℃左右)，而等温反应的酶在这样温度下会失活。同时，PCR防污染体系在扩增检测之前，增加了检测的时间，虽然高温下，UNG酶会变性失活，但是也有报道提示残留的UNG酶活性会干扰后续的扩增检测。

恒温扩增的防污染的方法如美国专利(专利号US 8945845 B2)披露的需要开管加入UNG酶，然后加入反应试剂和UNG酶抑制剂，需要开管两次，增加了实验操作步骤和核酸泄漏风险，延长检测时间。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的是提供一种化学修饰UNG酶、化学修饰方法以及化学修饰UNG酶的应用。这种化学修饰UNG酶能在低于某一温度下不表现酶活性，而在该温度以上孵育一段时间后去修饰就可以恢复正常活性，从而实现活性可控。该化学修饰UNG酶应用于常温或等温扩增中，可建立核酸常温或等温扩增的防污染体系，耗时短，操作简单，有效清除残余污染。