[发明专利]一种单克隆细胞株及其在测定IL‑6R抑制剂相对生物学活性中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种单克隆细胞株及其构建方法，以及利用该单克隆细胞株测定IL-6R抑制剂相对生物学活性的方法。

背景技术

白细胞介素-6(IL-6)是调节免疫反应和炎症反应的一种多效性细胞因子，与IL-6受体(IL-6R)结合后，可诱导软骨细胞和滑膜细胞产生基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-3和MMP-13(Hashizume M，Mihara M.Osteoarthritis Cartilage， 2009，17(11)：1513-1518)，还可通过诱导表达RANKL，从而促进破骨细胞的破骨作用，造成软骨的损伤(Hashizume M，Hayakawa N，Mihara M.Rheumatology，2008，47(11)：1635-1640)，在类风湿性关节炎患者的关节骨和软骨组织破坏方面显示出强大的作用。IL-6R抑制剂通过与IL-6竞争结合位点而抑制IL-6向胞内转导信号，阻断IL-6的生物学活性，从而起到治疗类风湿性关节炎的作用。

早在1988年，Shimizu等人就发现IL-6与IL-6R相结合之后可通过信号转导过程促进KT-3细胞的增殖，IL-6R抑制剂可通过竞争性地阻断IL-6与IL-6R 的结合从而抑制上述增殖反应(Shimizu S，Hirano T，Yoshioka R et al.Blood. 1988；5：1826-8)。因此，通过对该增殖反应的抑制程度进行测定，可有效评价IL-6R抑制剂的相对生物学活性。但KT-3细胞为悬浮细胞，且生长依赖特定的细胞因子，培养要求高，且该方法耗时长，重复性较差，导致测定结果不稳定。

IL-6可经一条直接通道JAKs(just another kinase,JAK)/STATs(signal transclucers and activators of transcription STAT)途径将信号从细胞表面受体转导至核，调控基因的转录，这一过程主要包括胞浆JAKs、STATs先后磷酸化，SIF (sis-inducing factor)复合物的形成、核转位及与c-fos启动区SIE(sis-inducing element)的结合(王小丹等，细胞生物学杂志，2003，1)，其中SIF复合物与 SIE的结合是IL-6信号通路的关键环节。但目前还没有应用此原理进行IL-6R抑制剂药物筛选及测定IL-6R抑制剂的相对生物学活性的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，基于现有技术中直接通道JAKs /STATs途径的原理，本发明构建了一种能够稳定表达SIE-荧光素酶报告基因的人肾上皮细胞株，上述细胞株在给予外源IL-6刺激的情况下可稳定表达荧光素酶，通过检测该细胞株所表达的荧光素酶的活性可以测定IL-6R抑制剂的相对生物学活性，本发明提供的方法将现有方法的耗时从72小时缩短至6小时，而且重复性更好，结果更稳定。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种单克隆细胞株，其为携带有受SIE调控的荧光素酶基因且能稳定表达荧光素酶的体外培养的哺乳动物细胞。

优选地，所述哺乳动物细胞为人肾上皮细胞293T细胞，也可采用其他类型的哺乳动物细胞，但采用人肾上皮细胞293T细胞效果最佳。

优选地，所述单克隆细胞株命名为293T-SIE，其分类命名为人肾上皮细胞系，其保藏编号为CGMCC No.13816，保藏日期为2017年3月22日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明的第二个目的是提供一种上述单克隆细胞株的构建方法，其包括如下步骤：

a)构建携带有受SIE调控的荧光素酶基因的质粒；

b)利用阳离子脂质体将步骤a)所述的质粒转染入人肾上皮细胞293T细胞；

c)在步骤b)转染后的细胞中加入潮霉素b，经过加压筛选，分离获得单克隆细胞株293T-SIE并冻存。

为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地，上述单克隆细胞株的构建方法还包括单克隆细胞株293T-SIE的荧光素酶活性的鉴定步骤。

优选地，所述潮霉素b的浓度为0～1mg/ml；更优选为0.2～0.6mg/ml；最优选为0.4mg/ml。

优选地，所述单克隆细胞株293T-SIE置于液氮介质中进行冻存，也可选择其他合适的冻存方式。