[发明专利]一种微载体悬浮培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法

权利要求书

1.一种利用搅拌瓶和生物反应器微载体培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法，其特征在于，以搅拌瓶和生物反应器微载体培养的CPB细胞作为鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的生产细胞；该方法具体包括以下步骤：

1)CPB细胞在125ml搅拌瓶中的微载体初期培养：将CPB单一细胞悬液接种至含0.28～0.32g已预处理微载体的125mL细胞培养搅拌瓶中，细胞的接种量为每个微载体上28～32个细胞；以每隔41～43min搅拌2.5～3.5min的方式间歇搅拌4.8～5.2h后；补加一倍体积的细胞培养液使微载体的终浓度为2.8～3.2g/L，此时培养液体积为100ml；以39～41r/min进行连续搅拌；

2)CPB细胞在500ml搅拌瓶中的微载体初次放大培养：

当上步细胞长至平台期时，将细胞消化后转移至含已预处理微载体的500mL细胞培养搅拌瓶中，新旧微载体数的比例为2.8～3.2：1，以每隔41～43min搅拌2.5～3.5min的方式间歇搅拌4.8～5.2h后，补加细胞培养液使微载体浓度为2.8～3.2g/L，此时培养液体积为400ml；以44～46r/min进行连续搅拌；

4)CPB细胞在3L生物反应器中的微载体二次放大培养：

当上步细胞长至平台期时，将细胞消化后移至含3.3g已预处理微载体的3L生物反应器中进行二次放大培养，以每隔41～43min搅拌2.5～3.5min的方式间歇搅拌4.8～5.2h后，补加细胞培养液至终体积1.5L，此时微载体浓度为2.8～3.2g/L，以54～56r/min进行连续搅拌；

5)鳜传染性脾肾坏死病毒或鳜弹状病毒制苗液的制备：

鳜传染性脾肾坏死病毒制苗液的制备：CPB细胞二次放大培养后的第71～73h，静置沉降微载体，去除上清液，用等体积孵育液洗涤，洗涤后以感染复数MOI为4.8～5.2加入鳜传染性脾肾坏死病毒感染细胞，并补加无血清的孵育液使体系体积为终体积的一半，以39～41r/min每11～13min搅拌2.5～3.5min，持续进行1.8～2.2h后，补加剩余含血清的孵育液至终体积，接毒后第118～122h沉降微载体，收集上清液，冻融，离心取上清，过滤取滤液，得病毒制苗液；

鳜弹状病毒制苗液的制备：CPB二次放大培养后的第95～97h，静置沉降微载体，去除上清液，用等体积孵育液洗涤，吸出孵育液，以感染复数MOI为0.09～0.11加入鳜弹状病毒感染细胞，并补加无血清的孵育液使体系体积为终体积的一半，以39～41r/min每11～13min搅拌2.5～3.5min，持续进行1.8～2.2h后，补加含血清的孵育液至终体积；接毒后第35～37h沉降微载体，收集上清液，冻融，离心取上清，过滤取滤液，得病毒制苗液。