[发明专利]一种微载体悬浮培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法

说明书

本发明公开了一种微载体悬浮培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法，本发明的方法包括选择CPB细胞作为制苗用细胞系；CPB细胞依次经搅拌瓶、生物反应器的逐级放大的微载体悬浮培养后作为病毒感染的宿主，最终获得鳜传染性脾肾坏死病毒液和鳜弹状病毒液。所制得的ISKNV效价高达8.34LgTCID₅₀/mL，SCRV效价高达10.25LgTCID₅₀/mL。本发明采用的微载体悬浮培养工艺操作简单，污染概率小，相对于转瓶培养方式劳动力小，生产成本较低。

技术领域

本发明涉及微载体培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法，属于细胞工程技术领域。

背景技术

传染性脾肾坏死病毒病是主要暴发在鳜身上的一种疫病，由虹彩病毒科肿大细胞病毒属中的传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus，ISKNV)引起，致死率超90％。患病鳜鱼的脾脏和肾脏出现出血和肿大等临床症状。该病每年给鳜养殖业带来巨大经济损失。

鳜弹状病毒病由弹状病毒科中的鳜弹状病毒(Siniperca Chuatsi Rhabdovirus，SCRV)引起，致死率超80％。患病鳜鱼主要表现出皮肤出血的临床症状。该病每年给鳜养殖业带来巨大经济损失。

目前疫苗预防是预防病毒病最有效的方法。

本实验室建立的鳜鱼脑组织细胞系(Chinese Perch Brain Cell Line，CPB)属于贴壁依赖型细胞，对鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒敏感，可用于生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒。

目前常用转瓶工艺培养细胞生产病毒，转瓶培养的环境条件难以监测和控制，细胞密度较低，且劳动强度大、成本较高和各批次病毒效价差异较大。而微载体悬浮培养工艺则优于转瓶培养工艺。

1967年，Van Wezel提出微载体概念，目前微载体培养技术在国外被广泛应用。微载体是指直径在60-250μm之间，表面可供细胞黏附生长的微球，在适当搅拌下可悬浮于培养液中。最初Van Wezel et al设计的微球DEAE-Sephadex A50因电荷量过大而对细胞有毒性，可抑制细胞生长，Levine et al合成的带电量2.0meq DEAE/g干重的DEAE-Sephadex，降低了带电量，可用于较高浓度的微载体培养细胞。微载体研究热点是新材料的研发，目前有十几种已经商品化，根据材料大致分为葡聚糖、明胶、纤维素、塑料、玻璃、聚苯乙烯、甲壳胺、藻酸盐凝胶以及磁性微载体等，应用最广的为Cytodex系列、Cytopore系列和Cytoline系列。

目前对于鳜传染性脾肾坏死病毒液和鳜弹状病毒液的疫苗研究报道较少，主要难题在于获得高滴度病毒存在技术困难，成本高、时间久。

发明内容

本发明的目的在于提供一种微载体悬浮培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种利用搅拌瓶和生物反应器微载体培养CPB细胞生产鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的方法，其特征在于，以搅拌瓶和生物反应器微载体培养的CPB细胞作为鳜传染性脾肾坏死病毒和鳜弹状病毒的生产细胞。

进一步的，上述方法具体包括以下步骤：

1)CPB细胞在125ml搅拌瓶中的微载体初期培养：

将CPB单一细胞悬液接种至含0.28～0.32g已预处理微载体的125mL细胞培养搅拌瓶中，细胞的接种量为每个微载体上28～32个细胞；以每隔41～43min搅拌2.5～3.5min的方式间歇搅拌4.8～5.2h后；补加一倍体积的细胞培养液使微载体的终浓度为2.8～3.2g/L，此时培养液体积为100ml；以39～41r/min进行连续搅拌；