[发明专利]一种可编程的多位点特异性的转录抑制系统及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种可编程的多位点特异性的转录抑制系统及其应用。

背景技术

可编程的位点特异性的基因调控元件在全基因组层次的基因功能研究、代谢通路调控以及人工基因线路设计中均发挥重要作用。目前，研究人员已经开发了诸多可编程的基因调控元件，包括RNAi(RNA interference)、工程化的DNA结合蛋白(如锌指蛋白ZFP(zinc-finger protein)、转录激活样效应蛋白TALE(transcription-activator-like effector protein)和基于CRISPR-Cas系统的CRISPRi。其中RNAi介导的基因敲低技术特异性较低且受作用机体限制，而基于DNA结合蛋白的调控技术，比如锌指蛋白ZFP及转录激活样效应蛋白TALE，在对特定位点进行调控时，需要对蛋白质序列进行重新设计，且得到的蛋白不一定具有良好的特异性，因而限制了其广泛应用。目前以Ⅱ型CRISPR-Cas9系统为基础的CRISPRi技术应用最为广泛，该技术系统中包含一个dCas9及一个工程化的sgRNA，对基因的特定位点进行调控时，只需要改变sgRNA中20bp的序列，而不要对蛋白序列做任何改变。尽管如此，该系统也存在一定问题，如多位点调控时sgRNA表达问题。而近期报道的Ⅴ-A型CRISPR-Cpf1系统，与CRISPR-Cas9系统相比，具有明显优势。首先，Cpf1在天然状态下由单个RNA引导，而Cas9在天然状态下由两个RNA(tracrRNA-crRNA)引导；其次，Cpf1蛋白除具有DNA切割酶活性外，还具有加工自身前体RNA(pre-RNA)的RNA酶活性，而Cas9只具有DNA切割酶活性，加工自身前体RNA时需要RNaseⅢ的参与；再者，与CRISPR-Cas9系统相比，该系统还具有更低的脱靶率，是除CRISPR-Cas9之外非常具有前景的基因组工程技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种可编程的多位点特异性的转录抑制系统及其应用。

本发明所提供的可编程的多位点特异性的转录抑制系统，可来自于CRISPR-Cpf1系统，具体可包括如下(A)和(B)：

(A)位点特异性转录抑制蛋白，或者能够表达所述位点特异性转录抑制蛋白的DNA环状质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA或mRNA；

所述位点特异性转录抑制蛋白为将来自于弗朗西斯菌(Francisella novicida)U112的Cpf1蛋白的第917位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸(D917A)后得到的蛋白；

(B)靶向多个位点的可编程sgRNA，或者能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA的DNA环状质粒或DNA线性片段；

所述靶向多个位点的可编程sgRNA，由19-36nt的重复序列以及可变的16-31nt的间隔序列自5’端到3’端依次交替排列构成。

其中，所述间隔序列为与预进行转录抑制的目的基因的靶标序列相结合的序列。对特定位点进行基因调控时，只需要改变所述靶向多个位点的可编程sgRNA中的所述间隔序列。

更加具体的，所述转录抑制系统可为如下(a)或(b)或(c)：

(a)由所述位点特异性转录抑制蛋白和所述靶向多个位点的可编程sgRNA组成；

(b)由既能够表达所述位点特异性转录抑制蛋白也能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA的DNA环状质粒或DNA线性片段组成；

(c)由能够表达所述位点特异性转录抑制蛋白的DNA环状质粒或DNA线性片段或体外转录的RNA或mRNA，以及能够转录所述靶向多个位点的可编程sgRNA的DNA环状质粒或DNA线性片段组成。

进一步，在所述靶向多个位点的可编程sgRNA中，所述重复序列的长度最好为19nt。所述间隔序列的长度最好为18-20nt。

其中，所述重复序列为来自于弗朗西斯菌(Francisella novicida)U112的sgRNA的重复序列。

具体的，所述位点特异性转录抑制蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列1所示。所述靶向多个位点的可编程sgRNA中，所述重复序列为至少含有序列表中序列2自3’末端起的19个核苷酸，并且从序列2自3’末端起的第20个核苷酸起沿着序列2向5’端延长，得到的长度为19-36nt的单链RNA。