[发明专利]基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法

权利要求书

1.基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：基因组DNA的提取：取全血200μL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，对DNA样本进行浓度和纯度检测，置于-20℃保存备用；

S2：CYP2C19多态性位点的引物设计：

下载CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)、CYP2C19*17(rs12248560)位点上下游各1kb范围的基因序列，设计PCR引物和焦磷酸测序引物：

PCR引物包括：

PCR引物1(SEQNO1)：

CYP2C19*2(rs4244285)上游引物5’Biotin-CCAGAGCTTGGCATATTGTATCTA；

PCR引物2(SEQNO2)：

CYP2C19*2(rs4244285)下游引物CGCAAGCAGTCACATAACTAAGC；

PCR引物3(SEQNO3)：

CYP2C19*3(rs4986893)上游引物5’Biotin-TCCCTGCAATGTGATCTGCT；

PCR引物4(SEQNO4)：

CYP2C19*3(rs4986893)下游引物TGGCTGTCTAGGCAAGACTGTAGT；

PCR引物5(SEQNO5)：

CYP2C19*17(rs12248560)上游引物TGATGGAGAAGGGAGAACTCTTA；

PCR引物6(SEQNO6)：

CYP2C19*17(rs12248560)下游引物5’Biotin-TGGCGCATTATCTCTTACATCA；

焦磷酸测序引物包括：

测序引物1(SEQNO7)：

CYP2C19*2测序引物AAGTAATTTGTTATGGGTTC；

测序引物2(SEQNO8)：

CYP2C19*3测序引物AACTTGGCCTTACCTG；

测序引物3(SEQNO9)：

CYP2C19*17测序引物TTGTGTCTTCTGTTCTCAA；

所述Bio为生物素标记；

S3：PCR扩增反应；

S4：焦磷酸测序：

1)制备预混液以固定PCR产物：80μl的反应体系包括Beads2μl，Bindingbuffer40μl，PCR产物10μl，高纯水28μl；

2)单链的分离：将测序引物稀释到0.3uM，并分配25μl到q24反应板的每个孔中，确保PCR管与q24反应板在上样时的方向相同。打开开关，将真空工具放到PCR管的孔中，持续15S，以捕获带有PCR产物的sepharose珠；用70％以纯冲洗真空工具5S；用变性溶液冲洗真空工具5S；用洗涤液冲洗真空工具10S；将真空工具提升到超过90度垂直，持续5S；关闭真空开关。将真空工具放到孔中，左右轻柔晃动，以释放含有磁珠的产物；

3)测序引物与DNA链退火：将q24反应板至于预热的q24板架上，在80℃加热块上加热焦磷酸测序样本2分钟，样本冷却至室温(15℃-25℃)后即可放入焦磷酸测序仪内测序；

S5：基因型分析：

焦磷酸测序结束后，通过Qiagen PyroMark Q24(德国凯杰公司)软件对结果进行分析，根据出峰的碱基和峰高分别判断各位点的基因型；其中，CYP2C19*2和CYP2C19*3为反向测序，CYP2C19*17为正向测序；每个样本结合CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17的检测结果得出该样本CYP2C19的基因型；

S6：Sanger测序验证：

将CYP2C19*2(681G>A)、CYP2C19*3(636G>A)和CYP2C19*17(-806C>T)3个SNP位点的PCR扩增产物进行检测，并与焦磷酸测序结果进行比对。

2.如权利要求1所述的基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，其特征在于，S2中所述CYP2C19*2的Tm值为50℃，CYP2C19*3的Tm值为53℃，CYP2C19*17的Tm值为49℃。