[发明专利]基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检验技术领域，具体是涉及基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法。

背景技术

检测CYP2C19多态性的方法除了金标准Sanger测序技术外，常用的还有限制性片段长度多态分析、飞行时间质谱[6]、DNA微阵列芯片、高分辨率熔解曲线分析、Taqman探针等技术[10]。这些技术对CYP2C19的基因分型都具有较高的准确性，但均存在一些不足，操作步骤较为繁琐，或是需要依赖昂贵的仪器，检测成本较高，不适合规模的推广应用。为适应临床对CYP2C19基因多态性检测的需要，有必要建立一种高效、快速、准确度高、灵敏度好、经济适用的检测方法。

焦磷酸测序是一种基于DNA序列分析的技术，是检测SNP最为准确的方法之一[7]，该方法适用于对已知短序列的测序分析，其敏感性和精确性能与金标准(Sanger测序法)相提并论，并能够实时、直观、准确、定量的提供待测序列的信息[8]，已广泛用于基因多态性检测、微生物分型、基因甲基化检测等领域[9]。

氯吡格雷是临床上常用的抗血小板聚集的药物之一，冠状动脉介入术(PCI)后患者需长期服用氯吡格雷来进行抗血小板治疗[1]。但临床上部分患者会出现氯吡格雷抵抗[4]，仍然会有心血管血栓事件的发生。氯吡格雷的主要代谢酶为细胞色素P4502C19，其编码基因CYP2C19的多态性是影响氯吡格雷疗效的主要遗传因素[2-3]。CYP2C19的等位基因以CYP2C19*1(野生型)、CYP2C19*2(681G>A)、CYP2C19*3(636G>A)和CYP2C19*17(-806C>T)较常见。基因型为CYP2C19*1/*17、CYP2C19*17*17的患者，其代谢型为超快代谢；基因型为CYP2C19*1/*1的患者，其代谢型为快代谢；基因型为CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3的患者，其代谢型为中代谢；基因型为CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3和CYP2C19*2/*3的患者，其代谢型为慢代谢。

因此，临床上应根据患者CYP2C19的基因型，指导氯吡格雷的个体化用药。为使临床实验室能快速检测CYP2C19的基因型，本发明拟采用焦磷酸测序技术建立一种CYP2C19基因多态性检测方法，并用Sanger测序法对其准确性进行验证。

发明内容

本发明提供的是基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，具有快速、准确、成本低的特点，适用于临床实验室对CYP2C19基因多态性的分型。

本发明的技术方案是：

基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，包括以下步骤：

S1：基因组DNA的提取：取全血200μL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，对DNA样本进行浓度和纯度检测，置于-20℃保存备用；

S2：CYP2C19多态性位点的引物设计：

在NCBI上下载CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)、CYP2C19*17(rs12248560)位点上下游各1kb范围的基因序列，采用PyroMark Assay Design Software2.0(德国凯杰公司)软件设计PCR引物和焦磷酸测序引物：

PCR引物包括：

PCR引物1(SEQNO1)：

CYP2C19*2(rs4244285)上游引物5’Biotin-CCAGAGCTTGGCATATTGTATCTA；

PCR引物2(SEQNO2)：

CYP2C19*2(rs4244285)下游引物CGCAAGCAGTCACATAACTAAGC；

PCR引物3(SEQNO3)：

CYP2C19*3(rs4986893)上游引物5’Biotin-TCCCTGCAATGTGATCTGCT；

PCR引物4(SEQNO4)：

CYP2C19*3(rs4986893)下游引物TGGCTGTCTAGGCAAGACTGTAGT；

PCR引物5(SEQNO5)：

CYP2C19*17(rs12248560)上游引物TGATGGAGAAGGGAGAACTCTTA；

PCR引物6(SEQNO6)：

CYP2C19*17(rs12248560)下游引物5’Biotin-TGGCGCATTATCTCTTACATCA；

焦磷酸测序引物包括：