[发明专利]一种表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株，是基因组中含有融合基因gox‑fopA‑C的工程菌；其中，所述工程菌株的出发菌是黑曲霉ATCC 20611，融合基因gox‑fopA‑C是葡萄糖氧化酶GOX编码基因gox与β‑呋喃果糖苷酶FopA‑C端结构域编码基因fopA‑C融合获得，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其上游为构巢曲霉的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA，下游为构巢曲霉色氨酸终止子TtrpC。本发明还公开了所述工程菌在制备低聚果糖中的应用，实验证实：该工程菌葡萄糖氧化酶活力达到90.0U/g，β‑呋喃果糖苷酶活力达到380U/g，菌丝体直接用于制备低聚果糖，其含量达到71.2％。本发明操作简便，可实现菌丝体一步酶法制备较高纯度的低聚果糖，具有较好的工业应用价值。

技术领域

本发明涉及一种表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株及其构建方法与在制备低聚果糖中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

低聚果糖(Fructooligosaccharides，简写为FOS)又称功能性果寡糖，是蔗糖分子上以β-1，2糖苷键结合数个D-果糖所形成的蔗果三糖(GF₂)、蔗果四糖(GF₃)和蔗果五糖(GF₄)及其混合物的总称。低聚果糖具有调节肠道菌群平衡、降低血脂、促进钙镁吸收等生理功效，广泛应用于食品、饮料及医药等领域。工业上通常采用微生物酶法大量生产低聚果糖，以高浓度蔗糖为原料，利用微生物产生的具有果糖基转移活性的β-呋喃果糖苷酶(EC3.2.1.26)催化合成。黑曲霉ATCC 20611是当前最主要的低聚果糖生产菌株，其产生的β-呋喃果糖苷酶(FopA)负责低聚果糖合成，工业上将发酵的菌丝体直接转化蔗糖进行低聚果糖的制备。葡萄糖是转化反应的副产物，对FopA具有非竞争性抑制效应，限制了低聚果糖合成效率，使得产物中低聚果糖含量只能达到55％-60％。转化产物中还含有30％左右的葡萄糖和10％左右的蔗糖，从而不适用于糖尿病人和龋齿患者食用。因此，消除低聚果糖合成产物中的葡萄糖对制备高纯度低聚果糖具有重要意义。

目前高纯度低聚果糖的制备方法可分为两种：一种是两步法，即先利用β-呋喃果糖苷酶转化蔗糖合成55％左右的低聚果糖，再采用色谱法等过滤除去葡萄糖和蔗糖，得到高纯度低聚果糖产品，但这种方法具有分离装置造价高、操作控制繁琐复杂、维护成本高等弊端，使得高纯低聚果糖生产成本居高不下；另一种是混合酶方法，即在β-呋喃果糖苷酶反应合成低聚果糖的体系中同时添加葡萄糖氧化酶，将副产物葡萄糖氧化为葡萄糖酸解除抑制效应，促进低聚果糖的进一步合成，从而获得较高纯度的低聚果糖，但该方法需要体外制备葡萄糖氧化酶，不仅增加了成本，且容易造成产物污染，不适合大规模的工业化生产。

迄今为止，国内外尚无在低聚果糖合成菌株中表达葡萄糖氧化酶的报道，亦未见利用葡萄糖氧化酶与β-呋喃果糖苷酶(FopA)C端结构域进行融合表达构建工程菌并应用于低聚果糖制备的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株及其构建方法与在制备低聚果糖中的应用。

本发明所述的表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株，其特征在于，该工程菌株是基因组中含有融合基因gox-fopA-C的工程菌；其中，所述工程菌株的出发菌是黑曲霉ATCC 20611；所述融合基因gox-fopA-C是葡萄糖氧化酶GOX编码基因gox与β-呋喃果糖苷酶FopA-C端结构域编码基因fopA-C融合获得，该融合基因gox-fopA-C的核苷酸序列如SEQID No.1所示，其上游为构巢曲霉的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA，下游为构巢曲霉色氨酸终止子TtrpC。

上述表达葡萄糖氧化酶的低聚果糖合成工程菌株中，所述的葡萄糖氧化酶GOX编码基因gox来自黑曲霉ATCC 1015基因组；所述的β-呋喃果糖苷酶FopA的C端结构域编码基因fopA-C来自黑曲霉ATCC 20611基因组，所述的启动子PgpdA和终止子TtrpC基因来源于质粒pAN7-1。