[发明专利]一种钻喙兰花粉的超低温保存方法

说明书

本发明公开了一种钻喙兰花粉的超低温保存方法，包括采粉和干燥、冻存、解冻。其中花粉干燥时放置在透气袋中进行，隔离了干燥剂对花粉的污染且透气性良好而具有很好的干燥效果；其次，本发明降低了玻璃化溶液PVS2中DMSO的浓度，在原有PVS2的成分基础上增加了丙二醇，丙二醇是具有渗透性且低毒的一类防冻剂。因此，本发明提供的一种钻喙兰花粉的超低温保存方法能长时间有效保证花粉活力，简单易行，可根据需要随时取出解冻用于授粉，在钻喙兰的育种和生产上具有重要的实践和推广意义。

技术领域

本发明属于超低温保存技术领域，具体地，涉及一种钻喙兰花粉的超低温保存方法。

背景技术

钻喙兰(Rynchostylis retusa)是兰科(Orchidaceae)树兰亚科(Epidendroideae)万代兰族(Vandeae)指甲兰亚族(Aeridinae)钻喙兰属(Rynchostylis)的一种附生型兰花，它花色淡雅且具芳香，小花密集，花序饱满而下垂，形似一条毛茸茸的狐狸尾巴，因此其商品被称为狐狸尾兰。钻喙兰主要分布于南亚、东南亚诸国以及我国的贵州和云南。

钻喙兰具有很高的观赏价值，也是育种的好材料，但钻喙兰在育种中的利用率远不如同属下的海南钻喙兰((Rynchostylis gigantea)。目前在英国皇家园艺学会(RHS)上登录的以钻喙兰属植物为亲本之一的30个杂交属、326个杂交种中，只有很少的一部分是由钻喙兰与其近缘属下的种和品种之间杂交获得的。导致这个状况的原因之一就是钻喙兰的花粉不易保存。钻喙兰的花粉寿命很短，在离开植株体后自然条件存放的花粉其活力直线下降，12小时后花粉萌发率降至10%以下，而在杂交育种过程中，常会出现花期不遇的情况，给杂交育种工作带来很大的不便。

兰科植物的花粉外包裹着类脂膜，因此花粉粒粘连成花粉块，而不同物种的花粉粒在大小、含水量等方面存在差异，导致不同种类的花粉在保存条件上也会有区别。目前尚没有关于钻喙兰花粉长期保存方法的报道，利用常规的兰科植物花粉保存方式，即将花粉块在无水氯化钙中干燥后置于-20℃冰箱中冷冻保存，我们发现钻喙兰的花粉在这样的保存条件下只能保持一段时间，约1个月以后其活力直线下降，如在实际操作中遇到与另一个种或品种花期相差1个月以上，常规的保存方法将无法满足育种需求。而在大多数植株组织、花粉超低温保存中使用的冷冻保护剂PVS2无法在钻喙兰花粉的超低温保存中发挥很好的效果，利用PVS2进行超低温保存后我们发现花粉活力下降较快，授粉后结实率也很低。因此，我们需要一种效果良好的长期保存技术来克服钻喙兰育种中存在的时间空间限制。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述缺陷，提供一种能长时间保持钻喙兰花粉活力，并对授粉效果没有影响的钻喙兰花粉保存方法。

为了实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种钻喙兰花粉的超低温保存方法，包括如下步骤：

S1.采粉和干燥：摘取新鲜花粉块，放入透气袋中密封，并将透气袋置于放有干燥剂的培养皿中，在0～4℃条件下放置1～3h；

S2.冻存：将花粉块取出，放入冻存管中，加入预处理液，室温下静置10～45 min；然后将冻存管中的预处理液吸出，加入玻璃化溶液MPVS2，将冻存管投入液氮保存；所述玻璃化溶液MPVS2的成分为：30% (w/v)甘油、15% (w/v)乙二醇、7.5～10% (w/v)丙二醇、5～7.5% (w/v)DMSO，用含有0.4M蔗糖的BK无机盐储备液配制，pH为5.7；

S3.解冻：将冻存管取出，解冻后将冻存管中原有的溶液吸出一半，并加入相应体积的冲洗液，静置5～10 min，如此重复2～4次。