[发明专利]一种天然利那洛肽的结晶方法

权利要求书

1.一种天然利那洛肽的结晶方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：

(1-1)在树脂中加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量，将4倍量的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；

(1-3)将4倍量的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和8倍量的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；

(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸；

(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽，所述的切割液为：三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝80％:5％:5％:5％:5％:0％；

(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；

(1-7)将上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽，所述的复性缓冲液由摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷、摩尔浓度为100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和摩尔浓度为10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5的混合液；

(2)称取相同质量的天然利那洛肽和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升；

(3)在上述步骤(2)的溶液中加入结晶溶液，利用蛋白结晶筛选方法，在温度为16℃-18℃，结晶时间为5天，得到天然利那洛肽的晶体。

2.如权利要求1所述的天然利那洛肽的结晶方法，其特征在于其中所述的树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂或王树脂。