[发明专利]一种天然利那洛肽的结晶方法

说明书

本发明涉及一种天然利那洛肽的结晶方法，属于药物制备技术领域。包括：以树脂作为固相载体，依照固相多肽合成的方法依次缩合具有N‑芴甲氧羰基(Fmoc)保护的D型氨基酸；待氨基酸缩合结束后，使用切割液进行侧链保护基团的脱除以及多肽与树脂的分离，通过乙醚沉淀切割液得到镜像利那洛肽的粗肽，再通过高效液相色谱分离、冻干，得到纯化后的还原态利那洛肽；最后，通过复性折叠实现二硫键的正确配对，即可得到具有正确空间构型的镜像利那洛肽；添加等浓度的镜像利那洛肽至天然利那洛肽的中性缓冲液中，充分混匀后，通过运用蛋白结晶筛选方法，采用不同的结晶溶液、特定温度及时间，实现镜像利那洛肽辅助天然利那洛肽的结晶。

技术领域

本发明涉及一种天然利那洛肽的结晶方法，属于药物制备技术领域。

背景技术

利那洛肽(Linaclotide)由14个氨基酸组成，其氨基酸序列为CCEYCCNPACTGCY，其中的第1位与第6位半胱氨酸、第2位与第10位半胱氨酸和第5位与第13位半胱氨酸分别形成二硫键，三对二硫键发挥着稳定其空间构型的作用。利那洛肽是鸟苷酸环化酶C(以下简称GC-C)的激动剂，可以通过结合肠道上皮的GC-C受体进而促进肠道内液体分泌的增多以及肠道蠕动的增加，也有助于降低痛觉神经的灵敏度。2012年美国FDA批准了利那洛肽(商品名：Linzess；公司：Ironwood)用于治疗成人的慢性特发性便秘(CIC)及便秘型肠易激综合征(IBS-C)。

以疾病相关的蛋白/多肽三维空间结构为基础进行药物设计与筛选的方法，具有目标明确，开发周期短的优点。因此，获得蛋白/多肽晶体具有重要意义。

专利(WO 2010/059733A；WO 2014/118180A)报道了在酸性溶液或有机溶剂的条件下，获得利那洛肽晶体的方法。该方法结晶条件较为苛刻，难于操作。因此本领域中仍然需要简单高效的方法来获得利那洛肽的晶体。

发明内容

本发明的目的是提出一种天然利那洛肽的结晶方法，运用多肽固相合成方法,获得镜像利那洛肽，并以镜像利那洛肽作为辅助手段，促进天然利那洛肽的结晶。

本发明提出的天然利那洛肽的结晶方法，包括以下步骤：

(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：

(1-1)在树脂中加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；

(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量，将4倍量的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；