[发明专利]一种酶法高效制备角膜脱细胞基质组织工程支架的方法

权利要求书

1.一种酶法制备角膜脱细胞基质组织工程支架的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将猪角膜基质板层置于稀释的Myroilysin酶溶液中，在35～38℃条件下进行脱细胞处理10～18 h，然后生理盐水、蒸馏水分别冲洗，制得猪角膜脱细胞支架板层；

所述Myroilysin酶溶液，采用如下方法制备：

（i）将经过活化的深海细菌Myroides profundi D25菌株接种于液体发酵培养基中，14～16℃发酵培养70～75 h；将发酵液离心取上清液，向上清液中加入硫酸铵至硫酸铵饱和度为60%，收集沉淀，经Tris-HCl重悬、透析后离心，再经离子交换层析分离纯化，G75分子筛分离纯化，制得弹性蛋白酶Myroilysin粗酶液；

（ii）将步骤（i）制得的弹性蛋白酶Myroilysin粗酶液经截留分子量为10000 Da的超滤管超滤浓缩，制得浓缩液，然后添加质量百分比15 %的甘油，分装保存在-80℃，即得；

所述稀释的Myroilysin酶溶液为用pH 9.0的50 mM Tris-HCl 缓冲液稀释Myroilysin酶溶液，制得甘油体积百分比占18～22%、Myroilysin酶质量浓度为100～1000 μg/ml的Myroilysin酶溶液；

（2）将步骤（1）制备的将猪角膜脱细胞支架放置在钻台上，滴加核黄素溶液20~40 min，并在波长为365 nm的紫外灯下照射30~60 min，然后生理盐水、蒸馏水分别冲洗，制成核黄素交联的猪角膜脱细胞支架；

（3）将步骤（2）制得的交联的猪角膜脱细胞支架经脱水、灭菌，4℃保存待用；

所述脱水为在无菌甘油中脱水22～28 h。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（i）中，离子交换层析为用DEAE阴离子柱通过0～0.8 M的NaCl梯度洗脱分离纯化。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（ii）中，浓缩液中Myroilysin酶的浓度为1.8～2.2 mg/ml。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，Myroilysin酶质量浓度为100 μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下处理18 h；Myroilysin酶质量浓度为300 μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下处理16h；Myroilysin酶质量浓度为500 μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下处理16h；Myroilysin酶质量浓度为800 μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下处理10 h；Myroilysin酶质量浓度为1000 μg/ml的Myroilysin酶溶液在37℃下处理10 h。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，猪角膜基质板层与稀释的Myroilysin酶溶液的质量体积比为1：20～30。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，处理为在转速为80 rpm的条件下震荡处理。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，核黄素溶液的浓度为1 mg/ml。